كمي، في الوقت الحقيقي وتحليل قاعدة الختان في نشاط إصلاح Lysates خلية الاستفادة من الآفات محددة منارات الجزيئية

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس معدلات إصلاح الحمض النووي والمستخلصات النووية للخلية في الوقت الفعلي باستخدام منارات جزيئية تتألق بمجرد إصلاحها. تتكون المنارات الجزيئية لإصلاح الاستئصال الأساسي من قليل النوكليوتيدات الديوكسي في هيكل حلقة جذعية يحتوي على آفة قاعدة واحدة مع ستة شقوق منحنية من فلوريسين أوكسي مترافقة مع النهايات الأولية الخمسة وديل موتي مترافقة مع النهايات الأولية الثلاثة عند طيها. يتم إخماد الستة عائلة بواسطة dab sil بطريقة غير فلورية عن طريق نقل طاقة رنين الغابات.

لتقييم نشاط إصلاح الحمض النووي ، يتم احتضان المنارات بالمستخلصات النووية الخلوية ، والتي تحتوي على إنزيمات الإصلاح. يتم التعرف على DNA Glycosylate وإزالة آفة الحمض النووي في المنارة. مواقع ABA الناتجة عبارة عن ركائز لنوكيل نوكلياز AP واحد أو واحد عند التعرف على ، يشق المرء العمود الفقري للحمض النووي في موقع ABA ، مما يسمح للحمض النووي الذي يحتوي على الأسرة الستة بالانفصال بحرية عن دبوس الشعر.

ينتج عن الانفصال عن المروي زيادة في التألق تتناسب مع مستوى إصلاح الحمض النووي ويمكن تقييمها في الوقت الفعلي باستخدام جهاز PCR الكمي في الوقت الفعلي. القدرة على إصلاح تلف الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لكل خلية وكل كائن حي. من بين العديد من مسارات إصلاح الحمض النووي الخلوي ، تعد أهداف إصلاح الاستئصال الأساسي ، والقواعد التالفة التي قد تنجم عن الإهانات المؤكسدة أو الكيميائية التي توضح دور العناصر الخلوية الفردية التي قد تؤثر على إصلاح استئصال القاعدة أحد الأهداف الرئيسية في دراساتنا المختبرية.

على هذا النحو ، أصبح قياس نشاط إصلاح الحمض النووي بدقة وحساسية أمرا مثيرا للاهتمام في مختبرنا. يمكن أن يوفر هذا الاختبار مثل هذه البيانات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل وضع العلامات على 32 PN والتحليل بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام هي أن تقنيتنا لا تستخدم ركائز مشعة مصنفة يمكنها قياس معدلات الإصلاح في الوقت الفعلي ولها نطاق ديناميكي كبير جدا.

علاوة على ذلك ، يمكن أن يستخدم هذا النهج العديد من الآفات الفلورية المختلفة و / أو الآفات الأساسية لتحديد خصوصية الركيزة. لقد أظهرنا أن هذا الاختبار كمي للغاية وحساس للغاية في بيئات مختلفة. هذا المقايسة الجزيئية لإصلاح الاستئصال الأساسي قابلة للتحليل الحركي.

تسمح الحساسية العالية وخصوصية الفحص بالقياس الكمي الدقيق لإصلاح الاستئصال الأساسي ، وبالتالي فهي مفيدة لشاشات مثبطات الإصلاح أو التحقق من الصحة. بالإضافة إلى ذلك ، فهو قابل للتكيف لقياس نشاط الإصلاح والأنسجة وتحلل الخلايا السرطانية لقياسات المؤشرات الحيوية الوظيفية. عند تصميم منارات جزيئية سيتم استخدامها لهذا الفحص ، ضع في اعتبارك قليل النوكليوتيدات الدقيقة التالية للحمض النووي التي يبلغ طولها 43 قاعدة كما هو موضح هنا.

اعمل بشكل جيد. تسلسل الحمض النووي ليس فريدا ، ولكن يجب أن يسمح بتكوين بنية دبوس الشعر. عندما يركع كما هو موضح هنا ، يتم تحقيق الخصوصية عن طريق إدخال آفات أساسية محددة مثل اليوراسيل أو رباعي هيدرو فورين.

في الموضع X ستة قواعد من الطرف الخمسة الأولي ، يجب أن يكون محتوى GC 32٪ على الأقل ويجب عدم وضع قاعدة GB في الطرف الخمسة أولي. يجب أن تترافق ستة فلوريسين كربوكسي أو ستة أفاد إلى الطرف الخامس الأولي، ويجب تعديل الطرف الثلاثة الأولي باستخدام dab sil. ستكون هذه هي الركيزة لبروتينات إصلاح الحمض النووي لضمان ارتباط ونشاط إطلاقات الجليكوزيل.

تم اختيار موضع الآفة لتوفير مساحة كافية من بنية دبوس الشعر ونهاية الحمض النووي. يجب أن يكون طول الجذع أو دبوس الشعر على الوجهين 15 زوجا أساسيا كحد أدنى. طول الحلقة الموصى به هو 13 قاعدة.

يجب أن تكون المنارة الجزيئية للتحكم مطابقة للمنارة الجزيئية التجريبية ، إلا أنها لا تحتوي على آفة الحمض النووي. لذلك لا ينبغي التعرف عليه بواسطة إنزيمات إصلاح الحمض النووي. بمجرد أن تكون المنارات الجزيئية في متناول اليد, يجب إجراء تقييم الجودة للتأكد من أن المنارات لا تتألق حتى يتم تسخينها.

ولتحديد درجة حرارة الانصهار المثلى ، يجب تنفيذ جميع الخطوات أثناء إجراء الاستخراج على الجليد أو عند أربع درجات مئوية. لضمان استقرار البروتين ، استعد للتجربة عن طريق التبريد المسبق. كوبان سعة لتر واحد لكل عينة من غرف غسيل الكلى العازلة ، وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، والأنابيب ، والمحاقن ، والإبر.

قم بتسمية 15 مليلتر من الأنابيب المخروطية وضعها على الجليد. استنشق وسط النمو من الخلايا ثم اغسلها مرتين ب 7.5 مل من PBS البارد بعد الغسيل الثاني. أضف خمسة ملليلتر من PBS البارد إلى كل طبق واستخدم رافع الخلايا لكشط الخلايا من اللوحة.

انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل مبرد سعة 15 ملليلتر ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 500 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية وتقدير حجم الخلية المعبأة بمقارنتها بكميات معروفة من السائل في أنابيب مماثلة. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة دقيقة أخرى ثم قم بإزالة PBS المتبقي باستخدام ماصة resus.

قم بتعليق حبيبات الخلية في 150 ميكرولتر من كاشف الاستخراج النووي واحد لكل 50 ميكرولتر من حجم الخلية المعبأة. ثم انقل الخلايا المعلقة إلى أنبوب 1.5 مليلتر مبرد مسبقا ودوامة لمدة 15 ثانية بسرعة عالية. بعد الدوامة ، احتضان الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق ، ثم الدوامة لمدة 15 ثانية أخرى وجهاز الطرد المركزي عند 13،000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها ، والتي تحتوي على الجزء السيتوبلازمي. يقوم Resus بتعليق الحبيبات في خليط من ميكرولتر واحد من كوكتيل مثبط البروتياز المعلق 100 × ، وميكرولتر واحد من 100 ملليمولار DTT و 75 ميكرولتر من استخراج السلاح النووي. كاشف اثنين لكل 50 ميكرولتر من حجم الخلية المعبأة.

خلايا الدوامة لمدة 15 ثانية بسرعة عالية. احتضن على الجليد لمدة خمس دقائق ومرة أخرى دوامة لمدة 15 ثانية عند جهاز طرد مركزي عالي السرعة عند 13,000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران يستخدم حقنة لنقل المادة الطافية ، والتي تحتوي على البروتينات النووية إلى شريط غسيل الكلى المنزلق مع قطع الوزن الجزيئي 7،000.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من DTT المولي إلى 500 مل من محلول غسيل الكلى المبرد مسبقا وقم بغسيل الكلى لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع التحريك اللطيف. بعد 90 دقيقة ، انقل كاسيت غسيل الكلى إلى دورق ثان يحتوي على 0.5 لتر من محلول غسيل الكلى المبرد مسبقا مع DTT وغسيل الكلى. المحللة لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع التحريك اللطيف بعد غسيل الكلى ، قد يتبلور المستخلص بسبب تركيزات البروتين العالية.

بعد ذلك ، أدخل حقنة جديدة في منفذ مختلف عن تلك المستخدمة لحقن الكاسيت وجمع محلول البروتين النووي المحلل من كاسيت غسيل الكلى. حاول تضمين بلورات ذات مظهر غائم عند إزالة محلول البروتين النووي الممحلول كفل. قم بتقسيم العينة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 20 ميكرولترا لكل منها تجميد سريع على الثلج الجاف ثم قم بتخزينها تحت الصفر 80 درجة مئوية لحين الحاجة.

تحديد تركيز البروتين وإجراء مراقبة الجودة كما هو موضح في المستند المصاحب. لإجراء فحص المنارة الجزيئية ، قم بإذابة وتخفيف محللات الخلية إلى ميكروغرامين لكل ميكرولتر من البروتين مع المخزن المؤقت لتفاعل إصلاح التدفق الأساسي الذي يحتوي على مليمول واحد من DTT ، قم بتخفيف المنارات الجزيئية إلى 200 ميكرومولار مع المخزن المؤقت لتفاعل إصلاح الاستئصال الأساسي. نظرا لأن جهاز PCR الكمي في الوقت الفعلي لا يستخدم عادة كمقياس فلور ، قم بتغيير طريقة التشغيل على جهاز PCR الكمي في الوقت الفعلي لجمع البيانات كل 20 ثانية عند 37 درجة مئوية لمدة 180 دورة على الأقل.

ثم كل 20 ثانية لمدة 15 دورة في أقصى مضان للمنارة الجزيئية للحصول على بيانات للتطبيع. اضبط حجم التفاعل على 25 ميكرولتر. ثم قم بإعداد تصميم اللوحة على الجهاز باستخدام برنامج النظام الحيوي المطبق مع تحديد المنحنى القياسي كنوع التجربة ، وأكمل تخطيط اللوحة.

ويبين مثال في هذا الجدول، والذي يمكن العثور عليه أيضا في المستند المصاحب. لا تضيف أي شيء إلى المنحنى المحدد جيدا كمنحنى قياسي. ضع المخزن المؤقت الأساسي لتفاعل إصلاح الاستئصال DTT تحلل خلية DTT بتركيز ميكروغرامين لكل ميكرولتر وجميع المنارات الجزيئية المستخدمة في التجربة على الجليد.

ثم أضف DTT إلى المخزن المؤقت الأساسي لتفاعل إصلاح الاستئصال إلى تركيز نهائي يبلغ ماصة مللي مولار واحدة. 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل إصلاح الاستئصال الأساسي مع DTT في كل بئر من صفيحة Q-R-T-P-C-R بصرية متوافقة على الجليد. بعد ذلك ، باتباع تخطيط اللوحة ، قم بإدخال المنارات في الآبار المناسبة.

يجب فحص كل مجموعة من المحللة والمنارة الجزيئية أو التحكم في ثلاث نسخ. أخيرا ، قم بإدخال خمسة ميكرولترات لكل بئر من المحللة النووية المخففة في الآبار المناسبة. من المهم أن تتذكر الحفاظ على جميع كواشف المنارة الجزيئية باردة وإدخال الماصة في اللوحة كخطوة أخيرة.

تذكر أن المحللات تحتوي على بروتينات نشطة وستبدأ في إصلاح المنارات الجزيئية بمجرد أن يتم نقلها إلى خليط التفاعل. وبالتالي, من المهم جدا الحفاظ على برودة جميع الكواشف لتقليل مقدار إصلاح المنارة الذي يحدث قبل البدء في أخذ القياسات. بمجرد إضافة كل شيء ، أغلق اللوحة بغشاء لاصق بصري واخلطها عن طريق النقر برفق على اللوحة.

ثم قم بإجراء دوران سريع لمدة عشر ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي لجمع الحلول في الجزء السفلي من الأنابيب أو اللوحة بعد الدوران ، وإدخال اللوحة في جهاز PCR الكمي في الوقت الفعلي وبدء الفحص بعد الانتهاء ، وتصدير البيانات الأولية ويفضل أن يكون ذلك بتنسيق Excel واتبع التعليمات الواردة في المستند المصاحب لتحليل البيانات بمجرد إجراء الحسابات اللازمة. ارسم بيانات التألق الطبيعية كنسبة مئوية من العائلة الحرة مقابل الوقت في ثوان في مخطط مبعثر مع الأخطاء المقابلة لتقييم نشاط إصلاح الحمض النووي وجودة المستخلصات النووية من خلايا LN 4 28 وخط خلية MPG الزائد المعين على أنه LN 4 28 ميلا في الغالون. تم إجراء الاختبار الموصوف في هذا الفيديو باستخدام منارة جزيئية تحتوي على ركيزة رباعي فورين كعنصر تحكم إيجابي.

كما هو موضح في هذا الشكل ، فإن كلا الخطين الخليين لهما نشاط قوي من كما يتضح من المنحدر الحاد ، ونشاط جليكوزات الحمض النووي الخاص بإزالة ركيزة MPG. يشار إلى هيبوكسانثين على أنه تم قياس HX في المحللات النووية من كلا خطي الخلايا. تم تحليل كل محللة باستخدام منارة جزيئية أساسية للتحكم في إصلاح الاستئصال أو منارة جزيئية HX لإصلاح الاستئصال الأساسي لمنارة التحكم LN 4 28 موضحة باللون الأخضر و LN 4 28 MPG موضحة باللون الأرجواني لمنارة hypo.

LN 4 28 باللون الأزرق و LN 4 28 ميلا في الغالون باللون البرتقالي. يتم الإبلاغ عن النتائج على أنها A متوسط وحدات التألق و B ، التألق الطبيعي. حدثت زيادة تعتمد على الوقت في التألق مما يدل على إصلاح HX في كل خلية.

تحتضن Lysate مع منارة الجزيئية HX كما هو متوقع. كان لخط خلية LN 4 28 MPG المشار إليه بالتتبع البرتقالي معدل إصلاح أعلى بكثير كما يتضح من التراكم الأسرع للمضان من خط الخلية الأبوي LN 4 28 ، الذي يحتوي على الحد الأدنى من بروتين MPG. وبالتالي ، يمكن قياس معدل إصلاح آفات الحمض النووي المحددة بواسطة بروتينات إصلاح محددة من مستخلصات الخلايا في الوقت الفعلي مع الحد الأدنى من مستويات الخلفية لانقسام الحمض النووي غير المحدد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم المنارات الجزيئية الخاصة بك وقياس معدلات إصلاح الحمض النووي في الوقت الفعلي باستخدام البروتينات المنقاة أو المحللات الخلوية. فيما يتعلق بالتحليل، من الضروري تقييم المدى الدينامي وقيم الخلفية عن طريق إدراج تفاعلات التحكم مثل مع أو بدون إشارات التحكم الإيجابية والسلبية. بالنظر إلى تباين البئر إلى البئر ، من المفيد تطبيع البيانات في الآبار الفردية إلى قيم الإدخال.

يتم تحديدها من خلال الخطوة الدقيقة عند درجة حرارة الانصهار. هذا وإدراج أصباغ أخرى مثل قالب الصخور سيفسد التباين المتأصل في أخطاء سحب العينات أو الاختلافات في أجهزة الكشف. سمحت لنا هذه التقنية بتوضيح تأثير مكونات إصلاح الاستئصال الفردية على نشاط الإصلاح الكلي وقدرته.

إنه حساس بما يكفي لكشف التغييرات الصغيرة التي لم يكن من الممكن اكتشافها بالطرق التقليدية.