كمي، في الوقت الحقيقي وتحليل قاعدة الختان في نشاط إصلاح Lysates خلية الاستفادة من الآفات محددة منارات الجزيئية

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس معدلات إصلاح DNA ومستخلصات النواة الخلوية في الوقت الفعلي باستخدام المنارات الجزيئية التي تومض بمجرد إصلاحها. تتكون المنارات الجزيئية الخاصة بآلية الإصلاح بالاستئصال الأساسي من قليلات نيوكليوتيد ديوكسي في بنية حلقة ساقية تحتوي على آفة في قاعدة واحدة، مع اقتران ستة من شقوق fluorescein في النهايات 5' واقتران dil في النهايات 3' عند الطي. يتم إخماد شق six fam بواسطة dab sil بطريقة غير فلورية عبر نقل طاقة فورستر الرنيني.

لتقييم نشاط إصلاح DNA، يتم تحضين المنارات (beacons) مع مستخلصات نووية خلوية تحتوي على إنزيمات الإصلاح. يقوم إنزيم DNA Glycosylate بالتعرف على الآفة في DNA الخاص بالمنارة وإزالتها. وتعتبر مواقع ABA الناتجة ركائز لإنزيم AP endonuclease one أو ape one، حيث يقوم APE one عند التعرف عليها بشطر هيكل DNA عند موقع ABA، مما يسمح لـ DNA الذي يحتوي على six fam بالانفصال بحرية عن دبوس الشعر (hairpin).

يؤدي الانفصال عن المطفئ (quencher) إلى زيادة في الفلورية تتناسب طردياً مع مستوى إصلاح DNA، ويمكن تقييم ذلك في الوقت الفعلي باستخدام جهاز PCR الكمي في الوقت الفعلي. وتعد القدرة على إصلاح تلف DNA أمراً حاسماً لكل خلية وكل كائن حي. ومن بين المسارات الخلوية المتعددة لإصلاح DNA، يستهدف إصلاح استئصال القاعدة (base excision repair) القواعد التالفة التي قد تنتج عن الإساءات التأكسدية أو الكيميائية، ويعد توضيح دور العناصر الخلوية الفردية التي قد تؤثر على إصلاح استئصال القاعدة أحد الأهداف الرئيسية في دراساتنا المختبرية.

وبناءً على ذلك، أصبح قياس نشاط إصلاح DNA بدقة وحساسية موضع اهتمام في مختبرنا. ويمكن لهذا المقايسة توفير مثل هذه البيانات. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الوسم بـ 32 PN والتحليل عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام، في أن تقنيتنا لا تستخدم ركائز موسومة إشعاعياً، ويمكنها قياس معدلات إصلاح DNA في الوقت الفعلي، كما أنها تتميز بمدى ديناميكي واسع جداً.

علاوة على ذلك، يمكن لهذا النهج استخدام عدة فلوروفورات مختلفة و/أو آفات قاعدية لتحديد خصوصية الركيزة. وقد أظهرنا أن هذا المقايسة كمية للغاية وحساسة جداً في ظروف مختلفة. كما أن مقايسة المنارة الجزيئية لإصلاح استئصال القاعدة هذه قابلة للتحليل الحركي.

تسمح الحساسية والخصوصية العاليتان لهذا المقايسة بالتقدير الكمي الدقيق لعملية إصلاح استئصال القاعدة، وبذلك تكون مفيدة لعمليات فحص مثبطات الإصلاح أو التحقق من صحتها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييفها لقياس نشاط إصلاح الحمض النووي في الأنسجة وتحللات الخلايا الورمية لقياسات المؤشرات الحيوية الوظيفية. عند تصميم المنارات الجزيئية التي ستُستخدم في هذه المقايسة، ضع في اعتبارك قسيمات الحمض النووي (DNA oligonucleotides) التالية المكونة من 43 قاعدة كما هو موضح هنا.

يجب أن تعمل العملية بكفاءة. تسلسل DNA ليس فريداً، ولكن يجب أن يسمح بتكوين بنية دبوس الشعر. وعندما يكون منحنياً كما هو موضح هنا، يتم تحقيق النوعية عن طريق إدراج آفات قاعدية محددة مثل uracil أو tetra hydro furin.

عند الموضع X الذي يبعد ست قواعد عن النهاية 5'، يجب أن يكون محتوى GC بنسبة 32% على الأقل، ولا ينبغي وضع قاعدة GB عند النهاية 5'. يجب ربط ستة جزيئات من carboxy fluorescein أو ستة fam بالنهاية 5'، بينما يجب تعديل النهاية 3' باستخدام dab sil. وسيكون هذا هو الركيزة لبروتينات إصلاح DNA لضمان ارتباط ونشاط glycosyl releases.

تم اختيار موقع الآفة لتوفير مساحة كافية بعيداً عن بنية دبوس الشعر ونهاية الـ DNA. يجب أن يكون طول الساق أو ازدواج دبوس الشعر 15 زوجاً قاعدياً كحد أدنى. وطول العروة الموصى به هو 13 قاعدة.

يجب أن يكون المنارة الجزيئية الضابطة مطابقة للمنارة الجزيئية التجريبية، باستثناء أنها لا تحتوي على آفة في DNA. وبناءً على ذلك، لا ينبغي أن تتعرف عليها إنزيمات إصلاح DNA. وبمجرد الحصول على المنارات الجزيئية، يجب إجراء تقييم للجودة للتأكد من أن المنارات لا تظهر فلورية حتى يتم تسخينها.

ولتحديد درجة حرارة الانصهار المثلى، يجب تنفيذ جميع الخطوات أثناء إجراء الاستخلاص على الثلج أو عند درجة حرارة 4 °C. ولضمان استقرار البروتين، يتم التحضير للتجربة عن طريق التبريد المسبق لـ: دوارق سعة 1 لتر (بواقع اثنين لكل عينة)، ومحاليل الديلزة المنظمة، وغرف الديلزة، وأنابيب الطرد المركزي الدقيق، ومحاقن، وإبر.

قم بتسمية أنابيب مخروطية سعة 15 milliliter وضعها على الثلج. اسحب وسط النمو من الخلايا، ثم اغسلها مرتين باستخدام 7.5 milliliters من PBS البارد. بعد الغسلة الثانية، أضف خمسة milliliters من PBS البارد إلى كل طبق واستخدم رافع الخلايا لكشط الخلايا من الطبق.

انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter مبرد، ثم قم بالطرد المركزي عند 500 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد، تخلص من السائل العلوي وقم بتقدير حجم الخلايا المترسبة من خلال مقارنته بأحجام سوائل معروفة في أنابيب مماثلة. قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة دقيقة أخرى، ثم أزل ما تبقى من PBS باستخدام ماصة.

قم بتعليق كتلة الخلايا في 150 µL من كاشف الاستخلاص nuke buster extraction reagent one لكل 50 µL من حجم الخلايا المدمجة. بعد ذلك، انقل الخلايا المعلقة إلى أنبوب سعة 1.5 mL مبرد مسبقاً وقم برجّه باستخدام جهاز vortex لمدة 15 ثانية بسرعة عالية. بعد الرج، حضن الأنبوب على الثلج لمدة خمس دقائق، ثم قم برجّه مجدداً لمدة 15 ثانية، وافصله بجهاز الطرد المركزي عند 13,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة والتخلص من السائل الطافي الذي يحتوي على الجزء السيتوبلازمي. أعد تعليق الراسب في خليط يتكون من 1 µL من 100 x protease inhibitor cocktail مُعلّق، و 1 µL من 100 mM DTT و 75 µL من nuke buster extraction reagent two لكل 50 µL من حجم الخلايا المترسبة.

قم برج الخلايا باستخدام جهاز vortex لمدة 15 ثانية بسرعة عالية. حضن العينات على الثلج لمدة خمس دقائق، ثم قم بالرج مرة أخرى باستخدام جهاز vortex لمدة 15 ثانية، وافصلها بجهاز الطرد المركزي بسرعة 13, 000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، استخدم سرنجة لنقل الطافي، الذي يحتوي على البروتينات النووية، إلى كاسيت دياليزة منزلق بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 7, 000.

بعد ذلك، أضف 500 µL من DTT بتركيز 1 M إلى 500 mL من محلول الديلزة المنظم المبرد مسبقاً، وقم بإجراء الديلزة للمحلل لمدة 90 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب اللطيف. وبعد مرور 90 دقيقة، انقل كاسيت الديلزة إلى دورق ثانٍ يحتوي على 0.5 L من محلول الديلزة المنظم المبرد مسبقاً والمحتوي على DTT وقم بإجراء الديلزة للمحلل لمدة 90 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب اللطيف. وبعد انتهاء عملية الديلزة، قد يتبلور المستخلص نتيجة لتركيزات البروتين العالية.

بعد ذلك، أدخل محقنة جديدة في منفذ مختلف عن المنفذ المستخدم لحقن الكاسيت، واجمع محلول البروتين النووي الذي تمت دياليزته من كاسيت الدياليز. حاول تضمين البلورات ذات المظهر العكر عند سحب محلول البروتين النووي المُديالز. قم بتقسيم العينة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة بحجم 20 µL لكل أنبوب، وقم بتجميدها سريعاً على الثلج الجاف، ثم خزنها في درجة حرارة -80 °C حتى وقت الحاجة.

حدد تركيز البروتين وأجرِ مراقبة الجودة كما هو موضح في المستند المرفق. ولإجراء مقايسة المنارة الجزيئية، قم بإذابة وتخفيف نواتج تحلل الخلايا لتصل إلى 2 µg/µL من البروتين باستخدام منظم تفاعل الإصلاح الاستئصالي الأساسي الذي يحتوي على 1 mM من DTT، ثم خفف المنارات الجزيئية إلى 200 µM باستخدام منظم تفاعل الإصلاح الاستئصالي الأساسي. وبما أن جهاز PCR الكمي في الوقت الحقيقي لا يُستخدم عادةً كمقياس فلورية، فقم بتغيير طريقة التشغيل في جهاز PCR الكمي في الوقت الحقيقي لجمع البيانات كل 20 ثانية عند 37 °C لمدة 180 دورة على الأقل.

ثم يتم ذلك كل 20 ثانية لمدة 15 دورة عند أقصى تألق للمسبار الجزيئي (molecular beacon) للحصول على بيانات المعايرة. اضبط حجم التفاعل على 25 µL. بعد ذلك، قم بإعداد تصميم الطبق على الجهاز باستخدام برنامج applied biosystem مع اختيار "المنحنى القياسي" (standard curve) كنوع للتجربة، ثم أكمل تخطيط الطبق.

يظهر مثال في هذا الجدول، والذي يمكن العثور عليه أيضاً في المستند المرفق. لا تضف أي شيء إلى البئر المختار كمنحنى قياسي. ضع منظم تفاعل إصلاح الاستئصال الأساسي وDTT ومحلول خلية ميتيز بتركيز 2 µg/µL وجميع المنارات الجزيئية المستخدمة في التجربة على الثلج.

ثم أضف DTT إلى محلول الإصلاح بالتنفيذ الأساسي المنظم للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 millimolar. انقل 15 µL من محلول الإصلاح بالتنفيذ الأساسي المنظم مع DTT إلى كل بئر في لوحة Q-R-T-P-C-R بصرية متوافقة على الثلج. بعد ذلك، وبناءً على مخطط اللوحة، انقل المنارات (beacons) إلى الآبار المناسبة.

يجب فحص كل مجموعة من المستخلص الخلوي والمنارة الجزيئية (molecular beacon) أو العينة الضابطة في ثلاث مكررات. وأخيراً، يتم سحب 5 µL من المستخلص النووي المخفف لكل بئر ووضعها في الآبار المناسبة. ومن المهم تذكر الحفاظ على جميع كواشف المنارات الجزيئية باردة، وأن تكون عملية نقل المستخلصات إلى الطبق هي الخطوة الأخيرة.

تذكر أن النواتج المستخلصة (lysates) تحتوي على بروتينات نشطة، وسوف تبدأ في إصلاح المنارات الجزيئية (molecular beacons) بمجرد نقلها بواسطة الماصة إلى خليط التفاعل. لذا، من المهم جداً إبقاء جميع الكواشف باردة لتقليل كمية إصلاح المنارات التي تحدث قبل البدء في أخذ القياسات. وبمجرد إضافة كل شيء، قم بإغلاق الطبق باستخدام فيلم لاصق بصري وامزج المحتويات عن طريق النقر بخفة على الطبق.

ثم قم بإجراء عملية طرد مركزي سريعة لمدة عشر ثوانٍ لتجميع المحاليل في قاع الأنابيب أو الصفيحة، وبعد انتهاء عملية الطرد المركزي، أدخل الصفيحة في جهاز PCR الكمي في الوقت الحقيقي وابدأ المقايسة، وعند الاكتمال، قم بتصدير البيانات الخام ويفضل أن تكون بتنسيق Excel، واتبع التعليمات الواردة في المستند المرفق لتحليل البيانات بمجرد إجراء الحسابات اللازمة. قم برسم بيانات الفلورة المعيرة كنسبة مئوية من fam الحر مقابل الوقت بالثواني في مخطط تشتت مع الأخطاء المقابلة لتقييم نشاط إصلاح DNA وجودة المستخلصات النووية من خلايا LN 4 28 وخط خلايا مفرط التعبير عن MPG والمسمى LN 4 28 MPG. تم إجراء المقايسة الموصوفة في هذا الفيديو باستخدام منارة جزيئية تحتوي على ركيزة APE one tetra furin كضابط موجب.

كما يظهر في هذا الشكل، يتمتع كلا الخطين الخلويين بنشاط قوي لإنزيم APE one كما يتضح من المنحدر الحاد، ونشاط DNA glycosate النوعي لإزالة ركيزة MPG. تم قياس الـ hypoxanthine المشار إليه بالرمز HX في مستخلصات نووية من كلا الخطين الخلويين. تم تحليل كل مستخلص باستخدام إما منارة جزيئية (molecular beacon) للتحكم في إصلاح استئصال القاعدة أو منارة جزيئية HX لإصلاح استئصال القاعدة؛ وتظهر منارة التحكم LN 4 28 باللون الأخضر، بينما تظهر LN 4 28 MPG باللون الأرجواني بالنسبة لمنارة hypo.

يظهر LN 4 28 باللون الأزرق، بينما يظهر LN 4 28 MPG باللون البرتقالي. تم تقديم النتائج كـ A متوسط وحدات الفلورة و B الفلورة المعيرة. حدثت زيادة في الفلورة تعتمد على الوقت في كل خلية، مما يشير إلى إصلاح HX.

تم تحضين المستخلص الخلوي مع المسبار الجزيئي HX كما هو متوقع. أظهر خط الخلايا LN 4 28 MPG، والمشار إليه بالمنحنى البرتقالي، معدل إصلاح أعلى بكثير، كما يتضح من التراكم الأسرع للفلورة مقارنة بخط الخلايا الأبوي LN 4 28، الذي يحتوي على حد أدنى من بروتين MPG. وبالتالي، يمكن قياس معدل إصلاح آفات DNA محددة بواسطة بروتينات إصلاح محددة من المستخلصات الخلوية في الوقت الفعلي مع وجود مستويات خلفية دنيا من انقسام DNA غير النوعي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم المنارات الجزيئية (molecular beacons) وقياس معدلات إصلاح DNA في الوقت الفعلي باستخدام إما البروتينات المنقاة أو مستخلصات الخلايا. وفيما يتعلق بالتحليل، من الضروري تقييم المدى الديناميكي وقيم الخلفية، ويتم ذلك من خلال إدراج تفاعلات ضابطة، مثل استخدام المنارات الضابطة الموجبة والسالبة أو عدم استخدامها. ونظراً للتفاوت بين الآبار، فمن المفيد تطبيع البيانات في الآبار الفردية بناءً على قيم الإدخال.

يتم تحديد ذلك من خلال الخطوة الأكثر دقة عند درجة حرارة الانصهار. وسيؤدي هذا، بالإضافة إلى إدراج صبغات أخرى مثل صبغة مرجعية، إلى معالجة التباين المتأصل في أخطاء الماصة أو الاختلافات في أجهزة الكشف. لقد أتاحت لنا هذه التقنية توضيح تأثير مكونات إصلاح استئصال القاعدة الفردية على النشاط والقدرة الإجمالية للإصلاح.

تتميز هذه الطريقة بحساسية كافية للكشف عن تغيرات طفيفة لم يكن من الممكن رصدها باستخدام الطرق التقليدية.