المعالجة بعد الإنتاج من الألياف Electrospun للهندسة الأنسجة

الهدف من هذا الإجراء هو إنتاج سبيكات (scaffolds) قابلة للتحلل الحيوي ومصنعة بالغزل الكهربائي، بحيث يمكن تعقيمها وجعلها ذات سمك كافٍ وقوة ميكانيكية مناسبة لهندسة الأنسجة السريرية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق غزل البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي كهربائيًا إلى بنيات أولية، سواء كانت عشوائية أو مرتبطة وموجهة أو ذات طبقات متتالية. وتتمثل الخطوة الثانية في إجراء تعديلات ما بعد الغزل على السبيكات عن طريق تجميع عدة طبقات معًا وتعقيمها.

بعد ذلك، يتم إدخال الخلايا إلى السقالات وتقييم أدائها أثناء وبعد الزراعة. وتتمثل الخطوة النهائية في إخضاع الخلايا لنظام تمارين لمحاكاة الإجهاد الفسيولوجي الذي ستواجهه الخلايا في الجسم من أجل تحضيرها لعملية الزرع. وفي النهاية، يمكننا تقييم استجابة الخلايا للتمرين عن طريق قياس المصفوفة خارج الخلية التي تنتجها استجابةً للشد الديناميكي.

تتميز هذه التقنية بتنوعها ومرونتها، مما يسمح بتصنيع مجموعة كبيرة من السقالات ذات خصائص معدلة خصيصاً للتطبيق المطلوب. على سبيل المثال، يمكن تصميم السقالات لعلاج الحالات الصعبة التي تتطلب ترميماً للأنسجة، مثل استبدال الفقد الواسع في الجلد لدى المرضى المصابين بحروق شديدة، أو ترميم الغشاء المخاطي الفموي التالف نتيجة الإصابة بالسرطان أو الصدمات. وبالرغم من أن هذا الفيديو يوضح إنتاجاً مستمراً للخلايا كعلامة على الإجهاد الديناميكي، يمكنك أيضاً النظر في مجموعة من بروتينات المصفوفة خارج الخلوية، بالإضافة إلى تقييم العديد من الجوانب الأخرى لبيولوجيا الخلية باستخدام خلايا مجهدة أو غير مجهدة.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة في الحصول على سبيكات قابلة للتكرار لأن عملية الغزل الكهربائي تتأثر بالعديد من المتغيرات. لذا، يعد التوضيح المرئي لمعالجة السبيكات المغزولة كهربائياً بعد عملية الغزل أمراً مهماً، وهو موضوع نادراً ما يتم مناقشته.

تعد معرفة هذه العملية ضرورية لتطبيق هذه التقنية بنجاح في العيادة. ابدأ بتغليف جامع مغزلي دوار برقائق الألومنيوم مع توجيه الجانب اللامع للخارج. ثم ضع أربع محاقن سعة 5 ml محملة بـ 5 ml من البوليمر المطلوب.

يُستخدم هنا حمض البولي لاكتيك في مضخة سرنجة. اضبط معدل التدفق على 40 µL في الدقيقة لكل سرنجة، ومسافة التشغيل عند 17 cm من طرف الإبرة إلى المندريل. بعد ذلك، اشحن إبر السرنجات بجهد +17,000 فولت وقم بالغزل الكهربائي من المسافة المناسبة على المندريل المغطى برقاقة الألومنيوم للحصول على ألياف محاذية.

قم بتدوير المندريل بسرعة 1000 RPM للحصول على ألياف عشوائية. قم بتدوير المندريل بسرعة 200 RPM. يمكن تخزين سدادات الغزل الكهربائي على رقائق الألومنيوم في وعاء محكم الغلق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius في وجود مادة مجففة لمدة أربعة أشهر على الأقل بعد الغزل الكهربائي لبوليمر PHBV Lotus الثاني.

نكرر هنا؛ أظهر الـ PLA تكوين طبقات فوق الـ PHBV، وذلك باستخدام المعايير والظروف العادية لغزل هذا البوليمر. ومرة أخرى، تعمل هذه العملية الإضافية على بناء طبقة مزدوجة من السقالة، مما ينتج سقالّة ثنائية الطبقة لإنتاج سقالة متعددة الطبقات بواسطة السخان.

قم بتجميع أربع رقائق من PLGA فوق بعضها البعض، ثم قم بتسخين الرقائق عند 60 درجة Celsius لمدة ثلاث ساعات لإنتاج سِقالة متعددة الطبقات عن طريق التلدين البخاري. صب 10 milliliters من DCM في حاوية ذات حجم مناسب. بعد ذلك، ضع أربع رقائق من PLGA فوق بعضها البعض وقم بتعليقها على ارتفاع 2 centimeters فوق DCM.

أخيراً، أغلق الحاوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتحقيق إنتاج سِقالة معقمة عن طريق الغزل الكهربائي، حيث يتم إذابة بوليمرات ذات درجة طبية معقمة عن طريق التحضين في DCM ثم غزل محلول البوليمر كهربائياً على رقاقة معقمة ملفوفة حول محور دوران مُعقم. بعد ذلك، وفي غطاء تدفق صفائحي معقم، يتم تحضين السقالة في أوساط نمو خالية من المضادات الحيوية للفترة المناسبة للتحقق من عقم العينات وفقاً للتطهير الإيثانولي التجريبي.

ضع السقالات في محلول من الإيثانول والماء المقطر لمدة 15 دقيقة. وللتعقيم بحمض البيرأسيتيك، اغمر السقالات في محلول من حمض البيرأسيتيك وPBS لمدة ثلاث ساعات.

لإجراء التعقيم بأشعة غاما في درجة حرارة الغرفة، يتم تعريض السقالات للإشعاع بجرعة قدرها 3 kGy باستخدام مصدر السيزيوم أولاً، ثم تُقطع السقالات إلى مستطيلات بأبعاد 5 mm في 20 mm. بعد ذلك، يُستخدم الميكرومتر لقياس سمك السقالة. ثم تُوضع المستطيلات في جهاز Bose electro force 3, 100.

احسب معامل يونغ والمرونة من خلال منحنى الإجهاد والانفعال الناتج عن رسم العلاقة بين الحمل والإزاحة بواسطة الجهاز. ابدأ بصبغ الخلايا بصبغة فلورية قبل استزراعها. ثم قم بتحضين الخلايا الليفية الجلدية البشرية الملتصقة في التريبسين وEDTA لمدة خمس دقائق عند 37 °C.

بعد ذلك، قم بطرد الخلايا المنفصلة مركزياً لمدة 10 دقائق عند 150 ×g في درجة حرارة الغرفة، وأعد تعليق الراسب في خمسة ملليلتر من DMEM. بعد العد، اضبط تركيز الخلايا من أجل الاستزراع ثم ازرع الخلايا على السقالات. الآن، قم بتصوير سطح السقالات الموُسمة باستخدام مجهر فلوري لاستقصاء تغلغل الخلايا؛ ويمكن استخدام مجهر بؤري متعدد الفوتونات لفحص التغلغل في عمق السقالات.

يمكن تحقيق اختراق يصل إلى حوالي 200 micron في معظم السقالات سواء كانت تحتوي على خلايا أو بدونها. بعد ذلك، وعقب استزراع السقالات الملقحة، يتم تثبيت العينات في 1 milliliter من الفورمالديهايد في PBS لمدة 20 دقيقة عند 37 °C. وبعد التثبيت، تُغسل العينات ثلاث مرات باستخدام 1 milliliter من PBS، ثم تُحضن كل عينة من العينات في 200 µL من الأجسام المضادة الأولية للإيلاستين لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

اغسل العينات ثلاث مرات إضافية في 1 mL من PBS، ثم حضّن العينات في محلول من الجسم المضاد الثانوي في PBS يحتوي على DPI لمدة 30 دقيقة. وأخيرًا، بعد غسل العينات مرة أخيرة في PBS، قم بتصوير العينات باستخدام المجهر الفلوري باستعمال إثارة بطول موجي 365 nm وانبعاث بطول موجي 460 nm لـ DPI، وإثارة بطول موجي 480 nm وانبعاث بطول موجي 533 nm للجسم المضاد الثانوي. أولاً، قم بتعقيم جهاز تنظيم التدفق والبالون باستخدام الموصدة (autoclave)، ثم في غرفة نظيفة، قم بإخراج الجهاز من عبوته داخل غطاء تدفق صفائحي في وضعية مناسبة للغزل الكهربائي.

بعد ذلك، قم بتوصيل محقنة سعة 50 milliliter مملوءة بمحلول PBS بماسورة فرعية لصمام ثلاثي الاتجاهات، وانفخ البالون باستخدام محلول PBS حتى يصبح منتفخاً. الآن، قم بغزل البوليمر المطلوب كهربائياً فوق البالون. باستخدام ظروف الغزل المعتادة ومسافة عمل تبلغ 10 centimeters، تكون الألياف الرطبة لزجة بما يكفي للالتصاق بسطح البالون دون أن تنفصل لاحقاً.

بمجرد جفاف السقالة، ضع البالون في وعاء معقم ثم انقل الوعاء إلى غطاء تدفق رقائقي مناسب لزراعة الخلايا. تعد عملية زراعة الخلايا على سقالة فوق بالون منتفخ لإخضاع الخلايا للتكييف الميكانيكي الحيوي الجزء الأكثر صعوبة في هذا الإجراء. ومن الضروري غمر البالون بشكل متكرر في محلول الخلايا من أجل ربط أكبر عدد ممكن من الخلايا بالسقالة.

وجدنا أن هذه العملية تستغرق حوالي 20 دقيقة. داخل خزانة السلامة البيولوجية، قم بإزالة البالون من الوعاء وضعه على سطح معقم، مثل طبق بتري المستخدم هنا، ثم قم بنقل معلق الخلايا بواسطة الماصة فوق البالون المغلف كل 20 ثانية لمدة 20 دقيقة لمحاولة توزيع الخلايا بالتساوي على سطح البالون. بعد ذلك، أعد البالون إلى وعاء الزرع وأضف الوسط الغذائي المسخن مسبقاً والمناسب لنوع الخلايا.

أخيرًا، قم بتوصيل جهاز النفخ بمضخة حقن، ثم قم بنفخ وتفريغ البالون حسب الحاجة لإحداث تمدد ثنائي المحور. يمكن استخدام مضخة حقن يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر لتحقيق نظام تمدد أكثر تعقيدًا. كما يمكن استخدام الغزل الكهربائي لإنشاء سبيكة (scaffolds) ذات بنيات عشوائية ومنظمة.

تتميز هذه العملية بأنها قابلة للتكرار والألياف الناتجة عنها متجانسة. على سبيل المثال، يمكن إنشاء ألياف متعامدة عن طريق الغزل الكهربائي لمجموعة من الألياف المصطفة على رقاقة ألومنيوم من خلال تدوير الرقاقة بزاوية 90 درجة، ثم القيام فوراً بالغزل الكهربائي لمجموعة ثانية من الألياف المصطفة فوقها. يمكن غزل العديد من أنواع البوليمرات كهربائياً بخصائص يمكن أن تختلف بشكل كبير كما هو موضح هنا لـ P-L-A-P-H-B-V-P-C-L و PLGA، مع ملاحظة أن P-L-A-P-C-L و PLGA جميعها عبارة عن سبيكة ميكرو-ليفية متجانسة.

يتم غزل PHBV على هيئة عقد لؤلؤ، حيث تربط الألياف النانوية خرزات يتراوح حجمها من 5 إلى 20 ميكرون. هنا، تم غزل السقالات في البداية باستخدام PHBV، ثم مُلئت المحاقن بـ PLA وغُزلت فوق سقالات PHBV. تظهر هذه الصور طبقات تمثيلية مفردة من PHBV وPLA.

توضح هذه الصورة كيف يبدو المقطع العرضي لطبقة ثنائية من A-P-H-B-V-P-L-A تتكون من قلادة نانوية ليفية كثيفة من PHBV وطبقة PLA ليفية ميكروية أكثر انفتاحاً، حيث تسهل جميع أنواع السقالات الثلاثة التصاق الخلايا وتكاثرها. وفي حال تطلب الأمر استخدام سقالات أكثر سمكاً، يمكن استخدام التشكيل الحراري بالبخار والسخان لدمج طبقات السقالات معاً كما هو موضح في الصور القليلة التالية. لا تنفصل طبقات السقالات التي خضعت للتشكيل الحراري، وقد يكون من الصعب جداً تحديد نقطة الالتقاء بين الطبقات.

تُظهر هذه الصورة مقطعاً عرضياً عبر سقالة PLA مُعالجة بالبخار والضغط، حيث تم وضع سقالات ليفية أولية تبلغ سماكتها حوالي 150 ميكرون معاً. ومن ثم استُخدم بخار DCM لإنتاج سقالات أكثر سمكاً تصل إلى 500 ميكرون. وتُظهر هذه الصورة نفس المقطع من الطبقة الثنائية الناتجة عن البخار والضغط بتكبير يعادل ضعف التكبير السابق تقريباً؛ نلاحظ في هذه الصورة كيف تتكون السقالة من طبقات من ألياف أكثر سمكاً تتخللها طبقات من ألياف أرق، والتي أُنشئت عن طريق الضغط الحراري، مما أدى إلى دمج طبقات الألياف الرقيقة والسميكة معاً لإنتاج سقالات ذات خصائص ميكانيكية معقدة.

مرة أخرى، تُظهر هذه الصورة نفس السقالة ذات الركبة الساخنة بأربعة تكبيرات مختلفة. يمكن تنفيذ التكبير السابق بواسطة أغشية طبقية باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا، حيث تُزرع كل منها على غشاء منفصل دون تداخل كما هو موضح في هذه الصور للخلايا الليفية الجلدية البشرية الملونة بصبغتين مختلفتين من صبغات تتبع الخلايا الفلورية. الصورة الأولى تظهر الخلايا الليفية على PLA مغلف كهربائياً.

تم تثبيت الخلايا وصبغها؛ هنا تم استزراع الأرومات الليفية المصبوغة على PHBV المغزول كهربائياً. في هذه التجربة، صُبغت الأرومات الليفية مسبقاً بصبغة Cell Tracker Green الحيوية. لاحظ أن الخلايا توجد على جانب PLA من الطبقة الثنائية.

تُظهر هذه الصورة مقطعاً تمثيلياً عبر طبقة ثنائية تحتوي على أرومات ليفية مصبوغة باللون الأحمر على سطح PHBV السفلي وأرومات ليفية مصبوغة باللون الأخضر على سطح PLA العلوي. في هذه الصورة، صُبغت الأرومات الليفية مسبقاً بصبغة تتبع الخلايا الحمراء (cell tracker red) أثناء نموها على سطح A-P-H-B-V. وبذلك، فإن استخدام الأصباغ الفلورية الحيوية يوفر منهجية ملائمة لمراقبة توزيع الخلايا على السقالة بينما لا تزال الخلايا في مرحلة النمو.

تؤثر طريقة التعقيم على السقالة وعلى المزرعة الخلوية اللاحقة. يوضح هذا الرسم البياني الخطي تأثيرات حمض الباراسيتيك، والتشعيع بغاما، والإيثانول على قوة الشد القصوى ومعامل يونغ لسقالة PLG.

تغير كل واحدة من طرق التعقيم قوة الشد القصوى ومرونة السقالات. كما يؤدي استزراع الخلايا على هذه السقالات إلى خفض إجهاد الشد الأقصى بشكل إضافي، ولكنها تزيد من المرونة. يوضح هذا المخطط البياني تأثير طريقة التعقيم على قطر الألياف في السقالة الواحدة.

ليس للإشعاع غاما تأثير ملحوظ على قطر الألياف، بينما يقلل حمض الباراسيتيك والإيثانول من قطر الألياف بنسبة 50% تقريباً. وبناءً على ذلك، فإن أفضل طريقة للحصول على سبيكات معقمة هي إنتاجها تحت ظروف عقمية. وتوضح هذه السلسلة الأخيرة من الصور أن الخلايا تظل حيوية أثناء التمدد الديناميكي كما أنها تنتج كميات متزايدة من الإيلاستين. لاحظ تطور اللون الأزرق الداكن الناتج عن الخلايا النامية كما تم الكشف عنه باستخدام المؤشر الأيضي MTT.

هنا، طورت الخلايا الملونة باللون الأزرق والمستنبتة على بالون وخضعت للتمدد ثنائي المحور ألياف إيلاستين كما يشير الصبغ الأخضر. وهذا يتناقض بشكل ملحوظ مع غياب الإيلاستين عندما يتم الحفاظ على الخلايا نفسها في ظروف سكون على سقالة بالون مماثلة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الاستنبات الساكن والتدفق السائل للخلايا في السقالات لبحث كيفية استجابة الخلايا لظروف استنبات مختلفة.

لقد أثبت تطوير استزراع الخلايا على سقالة مثبتة على بالون يمكن تمديده فائدة كبيرة، حيث مهد الطريق للباحثين في مجال هندسة الأنسجة لاستكشاف تأثير التهيئة الديناميكية للخلايا في البنى المُهندسة نسيجياً. لا تنسَ أن العمل مع مصادر الطاقة ذات الجهد العالي، والمذيبات، والليزرات، والخلايا البشرية يمكن أن يكون خطيراً، لذا يجب دائماً اتخاذ التدابير الوقائية وتلقي التدريب المناسب أثناء تنفيذ هذا الإجراء.