المعالجة بعد الإنتاج من الألياف Electrospun للهندسة الأنسجة

الهدف من هذا الإجراء هو إنتاج سقالات قابلة للتحلل كهربائيا يمكن تعقيمها وجعلها سميكة بدرجة كافية وذات قوة ميكانيكية مناسبة لهندسة الأنسجة السريرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق أول بوليمرات قابلة للتحلل الكهربائي في البنى الأولية ، إما عشوائية أو معتمدة وموجهة أو ذات طبقات متسلسلة. الخطوة الثانية هي تطبيق تعديلات ما بعد الغزل على السقالات عن طريق وضع عدة طبقات معا وتعقيمها.

إدخال الخلايا التالية إلى السقالات وتقييم أدائها أثناء وبعد الاستزراع. الخطوة الأخيرة هي إخضاع الخلايا لنظام تمرين لتقليد الإجهاد الفسيولوجي الذي ستواجهه الخلايا في الجسم من أجل إعدادها للزرع. في النهاية ، يمكننا تقييم استجابة الخلايا لممارسة الرياضة عن طريق قياس المصفوفة خارج الخلية التي تنتجها استجابة للتوتر الديناميكي.

هذه التقنية متعددة الاستخدامات ومرنة ، مما يسمح بصنع مجموعة كبيرة ومتنوعة من السقالات بخصائص معدلة خصيصا للتطبيق المطلوب. على سبيل المثال ، يمكن تصميم السقالات لعلاج الحالات الصعبة التي تتطلب إصلاح الأنسجة ، مثل استبدال فقدان الجلد الواسع النطاق في المرضى الذين يعانون من حروق شديدة أو إصلاح الغشاء المخاطي للفم التالف بعد السرطان أو الصدمة. على الرغم من أن هذا الفيديو يظهر إنتاجا دائما للخلايا كعلامة على الإجهاد الديناميكي ، إلا أنه يمكنك أيضا التفكير في مجموعة من بروتينات المصفوفة خارج الخلية بالإضافة إلى تقييم العديد من الجوانب الأخرى لبيولوجيا الخلية باستخدام الخلايا التي تمارس الرياضة أو غير التمرين.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة للحصول على سقالات قابلة للتكرار مما يتسبب في تأثر عملية الغزل الكهربائي بالعديد من المتغيرات. من المهم تقديم عرض مرئي لمعالجة السقالات الكهربائية المغزولة بعد الغزل. نادرا ما تتم مناقشته.

معرفة العملية ضرورية لتطبيق هذه التقنية بنجاح في العيادة. ابدأ بطلاء مجمع مغزل دوار بورق الألمنيوم بحيث يكون الجانب اللامع متجها للخارج. ثم ضع أربع محاقن سعة خمسة ملليلتر محملة بخمسة ملليلتر من البوليمر المعني.

هنا يتم استخدام حمض البولي لاكتيك في مضخة حقنة. اضبط معدل التدفق على 40 ميكرولتر في الدقيقة لكل حقنة ، ومسافة العمل على 17 سم من طرف الإبرة إلى المغزل. بعد ذلك ، قم بشحن إبر الحقنة إلى زائد 17 ، 000 فولت وتدور كهربائي من المسافة المناسبة على مغزل مغلف بورق الألمنيوم للألياف المحاذاة.

قم بتدوير الرجل عند 1000 دورة في الدقيقة للألياف العشوائية. قم بتدوير الرجل عند 200 دورة في الدقيقة. يمكن تخزين سقالات الكعكة الكهربائية على رقائق الألومنيوم في حاوية مانعة للتسرب عند أربع درجات مئوية في وجود مادة مجففة لمدة أربعة أشهر على الأقل بعد الغزل الكهربائي البوليمر الثاني PHBV Lotus.

مرة أخرى هنا. أظهر PLA الطبقات الموجودة أعلى PHBV ثم استخدام المعلمات والظروف العادية لدوران البوليمر هذا. مرة أخرى ، تبني هذه العملية المضافة طبقة مزدوجة من السقالة تنتج طبقة ثنائية لإنتاج سقالة متعددة الطبقات بواسطة السخان.

الركوع ، ضع أربع أوراق من PLGA فوق بعضها البعض ثم قم بتسخين الملاءات على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات لإنتاج سقالة متعددة الطبقات عن طريق الركوع بالبخار. صب 10 مل من ميثان DILU أو DCM في وعاء مناسب الحجم. ثم ضع أربع أوراق من PLGA فوق بعضها البعض وعلقها سنتيمترين فوق DCM.

أخيرا ، أغلق الحاوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتحقيق إنتاج سقالة معقمة عن طريق الغزل الكهربائي ، وإذابة البوليمرات الطبية المعقمة عن طريق الحضانة في DCM ثم الكهربائية. قم بتدوير محلول البوليمر على ورق معقم ملفوف حول مغزل معقم. ثم في غطاء تدفق شبكي معقم ، احتضان السقالة في وسط نمو خال من المضادات الحيوية للفترة المناسبة للتحقق من عقم العينات لكل تطهير تجريبي للإيثانول.

ضع السقالات في محلول الإيثانول والماء المقطر لمدة 15 دقيقة. لتعقيم حمض البيراسيتيك. اغمر السقالات في حمض الطفيليتيك ومحلول PBS لمدة ثلاث ساعات.

في درجة حرارة الغرفة لتعقيم جاما ، قم بإشعاع السقالات بجرعة ثلاثة كيلو رمادي باستخدام مصدر السيزيوم أولا ، وقم بتقطيع السقالات إلى مستطيلات بحجم خمسة ملليمترات × 20 ملم. ثم استخدم ميكرومتر لقياس سمك السقالة. ثم ضع المستطيلات في أداة Bose الكهربائية 3 ، 100.

احسب معامل الشباب ومرونته من الحمل مقابل الإزاحة كمنحنى إجهاد مرسومة بواسطة الأداة. ابدأ بتسمية الخلايا بصبغة فلورية قبل زرع الخلايا. ثم احتضان التقاء الخلايا الليفية الجلدية البشرية في التربسين و EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

ثم قم بتدوير الخلايا المنفصلة لمدة 10 دقائق عند 150 مرة G في درجة حرارة الغرفة وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من DMEM. بعد العد ، اضبط تركيز الخلية للبذر وبذر الخلايا على السقالات. الآن قم بتصوير سطح السقالات المسماة بمجهر فلوري للتحقيق في تغلغل الخلايا في عمق السقالات ، يمكن استخدام مجهر متحد البؤر متعدد الفوتونات.

يمكن أن يحقق ذلك تغلغلا يبلغ حوالي 200 ميكرون في معظم السقالات مع الخلايا أو بدونها. ثم بعد زراعة السقالات المصنفة ، قم بإصلاح العينات في مليلتر واحد من الفورمالديهايد في PBS لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد التثبيت ، اغسل العينات ثلاث مرات بمليلتر واحد من PBS ، والآن احتضن كل عينة في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية للإيلاستين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

اغسل العينات ثلاث مرات أخرى في مليلتر واحد من PBS ثم احتضان العينات في محلول من الجسم المضاد الثانوي في PBS الذي يحتوي على DPI لمدة 30 دقيقة. أخيرا ، بعد غسل العينات مرة أخيرة في صورة PBS ، تستخدم العينات الموجودة على المجهر الفلوري إثارة 365 نانومتر و 460 نانومتر مغفرة ل DPI و 480 نانومتر من الإثارة و 533 نانومتر للجسم المضاد الثانوي. قم أولا بالتعقيم لجهاز تنظيم التدفق والبالون ثم في غرفة نظيفة ، قم بتفريغ الجهاز في غطاء التدفق الصفحي في وضع الغزل الكهربائي.

بعد ذلك ، قم بتوصيل حقنة سعة 50 مليلتر مملوءة ب PBS بالأنبوب الفرعي للصنبور ثلاثي الاتجاهات وقم بنفخ البالون باستخدام PBS حتى يصبح منتفخا. الآن قم بتدوير البوليمر المطلوب على البالون. باستخدام ظروف الغزل العادية ومسافة العمل البالغة 10 سم ، تكون الألياف الرطبة لزجة بدرجة كافية للالتصاق بسطح البالون دون انفصالها لاحقا.

بمجرد أن تجف السقالة ، ضع البالون في وعاء معقم ثم انقل الوعاء إلى غطاء تدفق الصفيحة المناسب لزراعة الخلايا. يعد زراعة الخلايا على سقالة على بالون منتفخ لإخضاع الخلايا للتكييف الميكانيكي الحيوي أصعب جزء في هذا الإجراء. من الضروري وضع البالون بشكل متكرر بمحلول الخلية من أجل إرفاق أكبر عدد ممكن من الخلايا بالسقالة.

نجد أن هذا يستغرق حوالي 20 دقيقة. في الغطاء ، قم بإزالة البالون من الوعاء وضعه على سطح معقم ، مثل طبق بتري المستخدم هنا وتعليق خلية الماصة على البالون المطلي كل 20 ثانية لمدة 20 دقيقة لمحاولة توزيع الخلايا بالتساوي على سطح البالون. ثم ضع البالون مرة أخرى في وعاء الاستزراع وأضف وسائط دافئة مناسبة لنوع الخلية.

أخيرا ، قم بتوصيل جهاز النفخ بمضخة حقنة وقم بتضخيم البالون وتفريغه كما هو مطلوب لإعطاء انتفاخ ثنائي المحور. يمكن استخدام مضخة حقنة يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر لتحقيق نظام انتفاخ أكثر تعقيدا. يمكن استخدام الغزل الكهربائي لإنشاء سقالات ذات بنى عشوائية ومرتبة.

هذا قابل للتكرار والألياف موحدة. على سبيل المثال ، يمكن إنشاء ألياف متعامدة عن طريق الدوران الكهربائي لمجموعة من الألياف المحاذاة على رقائق الألومنيوم عن طريق تدوير الرقاقة 90 درجة ، ثم الدوران الكهربائي على الفور لمجموعة ثانية من الألياف المحاذاة فوقها. يمكن نسج العديد من أنواع البوليمرات بالأقطار بخصائص يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا كما هو موضح هنا ل P-L-A-P-H-B-V-P-C-L و PLGA لاحظ أن P-L-A-P-C-L و PLGA كلها سقالات ليفية موحدة دقيقة.

يتم نسج PHBV كعقد من اللؤلؤ بألياف نانو تربط حبات بحجم خمسة إلى 20 ميكرون. هنا تم غزل السقالات في البداية باستخدام PHBV ثم تم ملء المحاقن بجيش التحرير الشعبى الصينى وتم نسجها فوق سقالات PHBV. تظهر هذه الصور طبقات PHBV و PLA مفردة تمثيلية.

توضح هذه الصورة ما قد يبدو المقطع العرضي للطبقة الثنائية A-P-H-B-V-P-L-A مع قلادة نانوية ليفية كثيفة وطبقة PHBV وطبقة PLA الليفية الدقيقة الأكثر انفتاحا وكأنها جميع أنواع السقالات الثلاثة تسهل ارتباط الخلايا وتكاثرها. إذا كانت هناك حاجة إلى سقالات أكثر سمكا ، فيمكن استخدام البخار والسخان راكعا لدمج طبقات السقالات معا كما هو موضح في هذه الصور القليلة التالية. لا تتفكك طبقات السقالة الراكعة وقد يكون من الصعب جدا العثور على التقاطع بين الطبقات.

تظهر هذه الصورة قسما من خلال سقالة جيش التحرير الشعبى الصينى البخارية والراكعة حيث تم وضع سقالات ليفية أولية تبلغ حوالي 150 ميكرون معا. ثم تم استخدام بخار DCM لصنع سقالات أكثر سمكا تصل إلى 500 ميكرون. تظهر هذه الصورة نفس القسم من طبقة البخار الصفرية الثنائية مرتين تقريبا لاحظ التكبير السابق في هذه الصورة كيف تتكون السقالة من طبقات من ألياف أكثر سمكا مشتتة بطبقات من الألياف الرقيقة الناتجة عن السخان ، وطبقات راكعة من الألياف الرقيقة والسميكة معا لإنتاج سقالات ذات خصائص ميكانيكية معقدة.

مرة أخرى ، تظهر هذه الصورة نفس السقالة الراكبة على السخان أربع مرات. يمكن إجراء التكبير السابق بواسطة أغشية الطبقة بأنواع مختلفة من الخلايا ، يتم زراعة كل منها على غشاء منفصل دون الاختلاط كما هو موضح في هذه الصور للأرومات الليفية الجلدية البشرية الملونة بأصباغ مختلفة لتتبع الخلايا الفلورية. الصورة الأولى هي الخلايا الليفية على كعكة كهربائية جيش التحرير الشعبى.

تم تثبيت الخلايا وتلطيخها هنا تم زرع الخلايا الليفية الملطخة على كعكة كهربائية PHBV. في هذه التجربة ، تم تلطيخ الخلايا الليفية بجهاز تعقب خلايا الصبغة الحيوية باللون الأخضر. لاحظ أن الخلايا موجودة على جانب جيش التحرير الشعبى الصينى من الطبقة الثنائية.

هذه الصورة عبارة عن قسم تمثيلي من خلال طبقة ثنائية مع الخلايا الليفية الملطخة باللون الأحمر على السطح السفلي PHBV والأرومات الليفية ذات البقع الخضراء على السطح العلوي لجيش التحرير الشعبى الصينى. في هذه الصورة ، تم تلطيخ الخلايا الليفية باللون الأحمر المتتبع للخلايا أثناء نموها على سطح A-P-H-B-V. وبالتالي ، فإن استخدام الأصباغ الفلورية الحيوية يوفر منهجية ملائمة للنظر في توزيع الخلايا على سقالة بينما لا تزال الخلايا تنمو.

تؤثر طريقة التعقيم على السقالة وثقافة الخلايا اللاحقة. يوضح هذا الرسم البياني الخطي تأثيرات حمض الطفيليستيك وتشعيع جاما والإيثانول على قوة الشد القصوى ومعامل الشباب ل A PLG. سقالة.

كل طريقة من طرق التعقيم تغير قوة الشد القصوى ومرونة السقالات. تقلل زراعة الخلايا على هذه السقالات من إجهاد الشد النهائي ، ولكنها تزيد من المرونة. يوضح هذا الرسم البياني الشريطي تأثير طريقة التعقيم على قطر الألياف لسقالة فردية.

يوجد تأثير كبير على تشعيع جاما على قطر الألياف ، في حين أن حمض الطفيليستيك والإيثانول يقللان من قطر الألياف بنسبة 50٪ تقريبا ، وبالتالي ، فإن أفضل طريقة لتحقيق سقالات معقمة هي إنتاجها في ظل ظروف معقمة. توضح هذه السلسلة الأخيرة من الصور أن الخلايا تظل قابلة للحياة أثناء الانتفاخ الديناميكي وتنتج أيضا كميات متزايدة من الإيلاستين. لاحظ تطور اللون الأزرق الداكن الذي تنتجه الخلايا النامية كما تم اكتشافه باستخدام مؤشر التمثيل الغذائي. MTT.

هنا ، طورت الخلايا ذات اللون الأزرق المزروعة على بالون وتعرضت لانتفاخ ثنائي المحور ألياف الإيلاستين كما يتضح من التلوين الأخضر. يتناقض هذا بشكل ملحوظ مع نقص الإيلاستين عندما يتم الحفاظ على نفس الخلايا في ظل ظروف ثابتة على سقالة بالون متطابقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الثقافة الساكنة وتدفق السوائل للخلايا في السقالات للتحقيق في كيفية استجابة الخلايا لظروف الثقافة المختلفة.

أثبت تطوير الخلايا المزروعة على سقالة على بالون ، والتي يمكن أن تكون منتفخة ، مفيدا للغاية لأنه مهد الطريق للباحثين في مجال هندسة الأنسجة لاستكشاف تأثير التكييف الديناميكي للخلايا في التركيبات الهندسية للأنسجة لا تنس أن العمل مع إمدادات الطاقة عالية الجهد والمذيبات ، يمكن أن يكون الليزر والخلايا البشرية خطيرا ويجب دائما اتخاذ التدريب والاحتياطات المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.