الهندسة البكتيريا تمسكا من إنشاء واحدة الاصطناعية Curli OPERON

الهدف العام من التجربة التالية هو إعطاء خصائص ملتصقة للبكتيريا من أجل تسهيل فصلها عن الوسائط السائلة. يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم الكيرلي الاصطناعي أولا لتجاوز التنظيم الجيني المعقد وتمكين الإنتاج السهل والضخم للبوليمرات اللزجة. كخطوة ثانية ، يتم تصور البكتيريا الملتصقة وقياسها على البوليسترين ، مما يسمح بتقدير سريع لكفاءة الجهاز الاصطناعي.

بعد ذلك ، يتم تصور البكتيريا الملتصقة على الزجاج بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. من أجل مراقبة الأغشية الحيوية بشكل مباشر والحصول على معلومات عن هيكلها ، يتم الحصول على نتائج تظهر زيادة كبيرة في الالتزام في السلالة التي تؤوي الجهاز الاصطناعي بناء على كل من الالتزام وقياس النسبة المئوية والملاحظات المجهرية. الميزة الرئيسية لنهج البيولوجيا التركيبية على الطرق الحالية مثل الاستنساخ التقليدي ، هي أنه يمكن الحصول بسرعة كبيرة على بناء الجينات المطلوبة الواضحة المطلقة المطلقة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال المعالجة الحيوية ، مثل معالجة التحدي المتمثل في إزالة البكتيريا المحملة بالمعدن من النفايات المشعة. بشكل عام ، يعاني الأفراد الجدد على هذه الطريقة من صعوبة في معرفة أساسية حول الإشارات التنظيمية الجينية والتعامل مع قواعد البيانات. سيركز العرض المرئي على القياس الكمي والتصورات للفيلم الحيوي لأن هاتين الخطوتين يصعب تعلمهما بسبب هشاشة الإطارات الحيوية.

تتمثل الخطوة الأولى لتصميم الكارون الاصطناعي في تحديد التنظيم الجيني للجينات المجعدة وتوطين إشاراتها الداخلية والنسخية والانتقالية. يتم تحقيق ذلك باستخدام قواعد بيانات متخصصة مثل REON DB أو eco gene. تتمثل الخطوة التالية في تحديد الجينات الخمسة المطلوبة تماما للتخليق المجعد ، CSGB و CSGA وترميز مونومرات الألياف و CS-G-E-C-GF و CSGG لتشفير مركب إفراز الشباك ، واستخراج التسلسلات المختارة من قاعدة البيانات في إدارة بيانات تنسيق أسرع وفي السيليكو سيتم إجراء التحليل المسبق باستخدام برنامج إدارة الاستنساخ حيث أن مجموعة C-S-G-G-F-E مضادة للمعنى في جينوم الإشريكية القولونية.

يجب تحويل هذا التسلسل إلى نظيره المكمل العكسي. استخدم أدوات إدارة الاستنساخ لعمليات عملية جزيء عكس الجزيء، والصق تسلسل C-S-G-E-F-G خلف C-S-G-B-A باستخدام الوظيفة ربط. بعد ذلك ، أضف المروج المناسب PRCN أمام تسلسل C-S-G-B-A-E-F-G iCal.

موضع RCN بتشفير مضخة FLX RCNA ، المسؤولة عن إزالة السموم من النيكل والكوبالت ، ومنظم المعادن المماثل RCNR. في حالة عدم وجود الكوبالت أو النيكل ، يرتبط المثبط RCNR بصندوق RCNR الموجود على الحمض النووي ويمنع تنشيط النسخ الكامل للجينات النهائية. إذا ارتفع تركيز الكوبالت أو النيكل داخل الخلايا ، فإن ارتباط الكوبالت أو النيكل ببروتين RCNR يمنع تثبيت المثبط على المحفز ويزداد نشاط النسخ ل P-R-C-N-A عن طريق وضع الجينات المجعدة الخمسة المختارة تحت سيطرة المروج.

المجعد PRCN مفرطا في وجود الكوبالت والنيكل. قم بعد ذلك بتحسين إشارات النسخ عن طريق إضافة موقع ربط ريبوسوم مثالي أو RBS أمام أول A TG من CS gba وتسلسل الحمض النووي و RBS المثالي الثاني أمام تسلسل C-S-G-E-F-G. لتناسب معايير I GMs ، يجب أن يكون الجهاز محاطا ببادئة قياسية من الطوب الحيوي تحتوي على مواقع تقييد ل ECO R one و X-bar one ، ولاحقة تحتوي على مواقع تقييد ل SPE one و PST واحد لتسهيل المزيد من التجميع.

قد لا يحتوي جزء الطوب الحيوي نفسه على أي مواقع التعرف على ECO R one و PST واحد SPE واحد و X-bar R واحد. ومن ثم ، تم التخلص من هذه المواقع عن طريق تغييرات الطفرة الصامتة في تحليل تقييد السيليكو للجهاز الذي كشف عن موقع PST واحد ، وموقع واحد في تسلسل CSGA ، وموقع PST واحد في تسلسل RCNR وواحد ECO R واحد في جين CSGE. تم تعديل هذه المواقع عن طريق الطفرات الصامتة.

بمجرد اكتمال تصميم المقابل الاصطناعي ، قم بتشغيل محاكاة الترجمة باستخدام برنامج إدارة الاستنساخ. استخدم انفجار برنامج محاذاة التسلسل للتحقق من التماثل المثالي بين البروتينات المجعدة من النوع البري والبروتينات المشفرة بواسطة الاصطناعية لبدء هذا الإجراء لكل بئر من صفيحة البوليسترين 24 جيدا مع ملليلترين من M 63 ، الحد الأدنى من الوسط مع 0.2٪ جلوكوز تلقيح كل بئر مع 10 إلى ست خلايا من ثقافة بكتيرية بين عشية وضحاها. تنمو البكتيريا عند 30 درجة مئوية لمدة 18 إلى 48 ساعة دون هز كل عمود من صفيحة 24 بئر يمثل طريقة.

تضاف الكمية المناسبة من الكوبالت والمضادات الحيوية عند الحاجة. تستخدم الصفوف الثلاثة الأولى لتحديد البكتيريا الملتصقة A عن طريق حساب متوسط التكرارات الثلاثة. يستخدم الصف الأخير المتبقي لتصور الأغشية الحيوية عن طريق تلطيخ البنفسج البلوري بعد 18 إلى 48 ساعة ، واستعادة السوبينات التي تحتوي على خلايا العوالق من كل بئر من الصفوف الثلاثة الأولى من صفيحة 24 بئر ونقل السوبينات إلى أنبوب انحلال الدم.

اشطف كل بئر بعناية بملليلتر واحد من متوسط M 63 واسحب الغسيل في أنبوب انحلال الدم باستخدام السوبينات الأولي. يشار إلى هذا المسبح باسم خلايا السباحة المسماة S.الجزء السفلي من الآبار في الصفيحة الدقيقة مغطى بخلايا الالتصاق. لاستعادة الأغشية الحيوية ، أضف ملليلتر واحد من M 63 إلى كل منها.

اكشط جيدا بطرف الماصة ثم قم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل وانقل جزء الأغشية الحيوية إلى أنبوب انحلال الدم الجديد. دوامة الأنبوب لمدة 15 ثانية. اجمع جزء الأغشية الحيوية في أنابيب انحلال الدم.

يمثل هذا التجمع الخلايا المتصلة بالسطح المسماة B التي تنقل 200 ميكرولتر من جزء الغليان الحيوي والغشاء الحيوي من أنابيب انحلال الدم إلى صفيحة 96 بئر. تقدير عدد البكتيريا المرتبطة بالسطح والسباحة من الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. يتم حساب النسبة المئوية للالتصاق لكل طريقة باستخدام الصيغة B في 100 مقسومة على ثلاث مرات S زائد B.To تصور الأغشية الحيوية للصف الأخير فقط من 24 ، تتخلص لوحة البئر من خلايا العوالق من تلك الآبار.

أضف ملليلتر واحد من M 63 إلى كل بئر لشطف الأغشية الحيوية التي تم تطويرها في قاع اللوحة. جفف الصفيحة المكشوفة لمدة ساعة واحدة عند 80 درجة مئوية بعد ساعة واحدة ، أضف 100 ميكرولتر من البنفسج الكريستالي بنسبة 20٪ لشخصين لكل بئر متبوعا بغسل مكثف بالماء. مطلوب هيكل فلوري لهذا البروتوكول.

المضيف المناسب للبلازميد الذي يحمل المجعد الاصطناعي هو السلالة الواحدة e coli SCC ، والتي تعبر بشكل أساسي عن البروتين الفلوري الأخضر دون أي فرق ملحوظ عن السلالة الأم MG 1 16 55. قم بتحويل سلالة المضيف باستخدام بلازميد عفريت 57 يحمل الكيرلي الاصطناعي للحصول على سلالة S 23. قم بتحويل سلالة المضيف باستخدام قرص البلازميد للتحكم 18 للحصول على سلالة التحكم.

تنمو S 24 بين عشية وضحاها ما قبل الثقافات لسلالات S 23 و S 24 عند 30 درجة مئوية. في متوسط M 63 المكمل بالجلوكوز والأمبيسلين في اليوم التالي ، أضف 20 مل من متوسط M 63 إلى طبق بتري ثم قم بتلقيح 15 مل من M 63 في أطباق بتري مع 100 ميكرولتر من الثقافات المسبقة. أضف التركيز المناسب من الكوبالت ولا تنس التحكم السلبي بدون الكوبالت.

أدخل ثلاثة أغطية زجاجية مستطيلة في كل طبق بتري. احتضان الأطباق طوال الليل عند 30 درجة مئوية دون رج. يمكن تصور البكتيريا مباشرة تحت المجهر الفلوري في الأيام التالية.

المهم تجنب تجفيف العينة ، لذلك يجب تنفيذ الخطوات التالية بعناية ولكن بسرعة. قم بإزالة كل زلة غطاء من أطباق بتري وصفيها بعناية. نظف الجزء السفلي من الوجه بعناية باستخدام قطعة قطن صغيرة مبللة ب 70٪ إيثانول لمسح جميع بقايا البكتيريا للمراقبة متحدة البؤر.

قم بإيداع زلة الغطاء على شريحة زجاجية مع وضع الوجه العلوي مغطى بالأغشية الحيوية ووجهه لأعلى. ثم يتم تغطية الأغشية الحيوية بزلة غطاء أكبر ، يتم تثبيتها على الزجاج. شريحة مع الورنيش.

اقلب الإعداد بحيث يكون الفيلم الحيوي الآن على الوجه السفلي. ضع الإعداد تحت مجهر الليزر متحد البؤر في هذه التجربة. يتم استخدام مجهر ليزر متحد البؤر Zeiss LSM five 10 meta في منصة التصوير المقطعي المحوسب الصغيرة.

حدد هدف الغمر بالزيت 40 مرة. استخدم الإعدادات التالية ، وقم بإثارة GFP عند 4 88 نانومتر وجمع التألق البكتيري في حدود 500 إلى 600 نانومتر. استخدم هدف الغمر بالزيت 40 مرة للحصول على الصور.

في وضع البؤر للمسح بالليزر. امسح الهياكل الكلية ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية من السطح الصلب إلى الواجهة مع وسط النمو. باستخدام خطوة ميكرون واحد.

قم بإجراء إسقاطات ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج maus ، وتحديد سمك الأغشية الحيوية من خلال تحليل متوسط قيمة C على طول المقاطع الطولية الإحصائية. القياس الكمي للأغشية الحيوية ، يمكن استخراج الأحجام الحيوية من مداخن Z متحدة البؤر. يمكن تقييم قدرات الالتصاق ب الإشريكية القولونية المصممة للإفراط في إنتاج المجعد استجابة للمعدن بطرق بسيطة.

على سبيل المثال ، يسمح تلطيخ البنفسج البلوري على 24 لوحة إيرين مصقولة جيدا بالتصور السريع لتكوين الأغشية الحيوية في قاع كل بئر ، كما يتضح من الاختلاف في كثافة اللون الأرجواني. يبدو أن سلالة النوع البري أقل التصاق من السلالة الهندسية. تتمثل الطريقة الكمية في قياس النسب المئوية للالتصاق بالبوليسترين من النوع البري والسلالات الهندسية بتركيزات مختلفة من الكوبالت.

تكشف النتائج المقدمة في هذا الرسم البياني أن النسبة المئوية للتصاق السلالة المهندسة أعلى بمقدار 1.5 مرة من سلالة النوع البري في غياب الكوبالت. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ تعزيز كبير للالتصاق في وجود تركيزات متزايدة من الكوبالت في الوسائط التي تحتوي على تركيزات كوبالت تبلغ 25 ميكرومولار أو 50 ميكرومولار من الخلايا الهندسية الملتصقة تصل إلى 30٪ و 40٪ على التوالي. يمكن أيضا مقارنة قدرات الالتصاق باستخدام الفحص المجهري مع البكتيريا الموسومة ب GFP المزروعة على الشرائح الزجاجية ، وتكشف ملاحظات الفحص المجهري الفلوري epi للبكتيريا الخضراء على خلفية سوداء أن السلالة المهندسة تشكل غشاء حيوي ، في حين أن سلالة التريب البرية تشكل فقط مستعمرات صغيرة مشار إليها بواسطة الأسهم.

يوفر تحليل الفحص المجهري متحد البؤر رؤية شاملة للبنية ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية. تظهر عمليات إعادة بناء المنظر العلوي في اللوحات A وتظهر عمليات إعادة بناء المنظر الجانبي في اللوحات B ، وتؤكد النتائج أن السلالة الهندسية أكثر التصاق وتشكل غشاء حيوي أكثر كثافة وسمكا من النوع البري. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التحقق مرة أخرى من تصميم العملية ، على سبيل المثال ، لاستكشاف إمكانات الوساطة الحيوية للإشريكية القولونية المعدلة أو النمل المشاغل في سياق مياه الصرف الصحي المشعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم فتح اصطناعي باستخدام برنامج إدارة الاستنساخ وكيفية تحديد نطق السلالات البكتيرية بسرعة. لا تنس أن العمل مع الجينات الاصطناعية والكائنات المعدلة وراثيا يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب أن تكون تحت القوانين الحالية والاحتياطات مثل التعقيم ، يجب دائما اتخاذ البكتيريا المحولة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.