A الفحص انجذاب غلفاني لتحليل حركية العصبية السلائف الهجرة خلية في الحقل الحالي مباشرة التطبيقية خارجيا الكهربائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور هجرة الخلايا السليفة العصبية المشتقة من البالغين في وجود مجال كهربائي مباشر. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل وزراعة الخلايا السلائف العصبية تحت البطانة البطانية أولا من الفأر البالغ. الخطوة التالية هي تحضير غرف Galvan Axxis ونقل الخلايا السليفة العصبية إلى الغرف.

تتمثل الخطوة الأخيرة في تطبيق مجال كهربائي تيار مباشر عبر غرفة Galvan Axxis وإجراء تصوير بفاصل زمني لمراقبة هجرة السلائف العصبية. في النهاية ، يلتقط الفحص المجهري للتصوير بفاصل زمني خصائص تكتيك Galvan للسلائف العصبية في حالاتها المتمايزة وغير المتمايزة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لواحة جلفان الخلية السلائف العصبية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل نموذج ضربة الفأر لتجنيد السلائف العصبية في مواقع الآفات لتعزيز الإصلاح العصبي.

سيوضح الإجراء روب بيلي بوست ، طالب دراسات عليا من مختبري. عند بدء هذا الإجراء ، يجب أن تكون الشخصيات غير القابلة للعب في المزرعة لمدة سبعة أيام ، بحيث تكون المجالات العصبية الأولية العائمة الحرة جاهزة للحصاد. عند الحاجة ، ابدأ في تحضير ثلاث غرف Galvan Axxis عن طريق وضع ثلاثة زجاج مربع.

رقم واحد ، ينزلق الغطاء في زجاجة من ستة حمض هيدروكلوريك عادي بين عشية وضحاها. في وقت مبكر من اليوم التالي ، قم بإعداد جل ماترا ليذوب ببطء على الجليد. بعد أربع ساعات ، ستكون جاهزة للاستخدام في بناء الغرفة.

أولا ، استخدم قاطع زجاجي ذو طرف ماسي لقطع ستة شرائح مستطيلة من الزجاج من مربع جديد. رقم واحد ، زلات الغطاء. انقل الزلات المربعة المغسولة بالحمض والزلات المستطيلة إلى غطاء التدفق الرقائقي.

اغسل الشرائط الزجاجية بنسبة 70٪ من الإيثانول متبوعا بماء الأوتوكلاف بدرجة زراعة الأنسجة. اسمح لهم بتجفيفها في الهواء أو تجفيفها على ورق خال من النسالة. بعد ذلك ، ضع الشحوم المفرغة على محيط سطح واحد من كل شريحة زجاجية مربعة وأغلقها على قاعدة بلاستيك 60 ملم.

أطباق بتري. ضع الشحوم المفرغة على جانب واحد من الشرائط الزجاجية المستطيلة وأغلقها على الحواف المتقابلة للمربع. ينزلق الزجاج لإنشاء مربعات مع حوض مركزي في وسط كل طبق.

الأشعة فوق البنفسجية بتعقيم هذه المربعات أو الغرف الزجاجية المعدلة لمدة 15 دقيقة على الأقل في غطاء المحرك. بعد ذلك ، ضع الماصة من 250 إلى 300 ميكرولتر من البوليول ليسين على الحوض المركزي للغرف. ثم احتضان الغرف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، قبل 15 دقيقة تقريبا من انتهاء الحضانة.

قم بإعداد محلول ماتري هلام بعد ساعتين ، وشفط البوليول ليسين واغسل الأحواض المركزية بمليلتر واحد من ماء الأوتوكلاف. ثم قم بوضع 250 إلى 300 ميكرولتر من محلول هلام ماتري على الأحواض المركزية واحتضان الغرف عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة. بعد الحضانة ، استنشق محلول ماتريجل.

ثم اغسل الأحواض المركزية برفق بملليلتر إلى ملليلترين من SFM. الآن قم بوضع 100 ميكرولتر من E-F-H-S-F-M أو F-B-S-S-F-M على الأحواض المركزية استعدادا للخلايا المستزرعة. بعد ذلك ، قم بإدخال أربعة إلى خمسة ملليلتر من المجال العصبي الذي يحتوي على ثقافة في طبق بتري جديد مقاس 60 ملم.

ثم ضع طبق بتري على منصة مجهر العد تحت هدف العرض خمسة ×. استخدم ماصة P 10 لنقل خمسة إلى ثمانية مجالات عصبية كاملة برفق إلى الحوض المركزي لكل حجرة. ما يصل إلى أربعة.

يمكن نقل المجالات العصبية في وقت واحد ، لكن لا تفصلها عن المجالات العصبية في الأحواض المركزية. انشرها بعناية دون تعطيل ركيزة matrigel. ثم أضف 150 ميكرولترا إضافيا من E-F-H-S-F-M أو F-B-S-S-F-M على الأحواض المركزية.

الآن الثقافة ، الخلايا في حاضنة رطبة. بعد 17 إلى 20 ساعة في الثقافة ، ستتوفر الشخصيات غير المتمايزة غير القابلة للعب بعد 69 إلى 72 ساعة. في الثقافة ، ستتوفر الشخصيات غير القابلة للعب متباينة.

تحت المجهر المحاسبي ، حدد الغرفة التي تحتوي على أفضل الخلايا لتحليل هجرة تصوير الخلايا الحية. يجب أن تكون الخلايا مستديرة منفصلة تماما تقريبا عن جرائها العصبية ولم تبدأ بعد ، أو بدأت للتو في تكوين عمليات في غطاء المحرك. تحضير غطاء الغرفة.

اغسل زلة غطاء زجاجي مربعة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم بالماء المعقم وقم بتطبيق شريط من الشحوم المفرغة على حافتين متوازيتين. الآن قم بتغطية الغرفة. أولا ، قم بشفط وسائط الثقافة من الحوض المركزي ، ثم أغلق الغطاء بسرعة ، وانزلق على الجدران المستطيلة مثل السقف.

بعد ذلك ، باستخدام العمل الشعري ، قم بتحميل 100 ميكرولتر من الوسائط الجديدة في الحوض المركزي. استخدم الآن الشحوم المفرغة لإنشاء حدود لمجموعات وسائط الثقافة. على كل طرف من طرفي الحوض المركزي في نظام تصوير الخلايا الحية ، أعدت أنابيب هلام agros ، وأقطاب كهربائية من الفضة ، وكلوريد الفضة ، وطبقين من أطباق بتري مقاس 60 ملم لاستخدامها.

كخزانات وسائط استزراع ، اسمح للغرف بالراحة داخل بيئة 37 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 إلى 30 دقيقة. خلال هذا الوقت ، قم بإعداد أغطية طبقي بتري الفارغين وغطاء طبق بتري غرف Galvan Axxis عن طريق حفر ثقوب فيها باستخدام ماصة Dremel أو أداة ، من 1.5 إلى ملليلتر من الوسائط على جانبي الحوض المركزي وأضف سبعة إلى ثمانية ملليلتر من SFM في كل طبق بتري فارغ. ضع طبق بتري واحد على كل جانب من الحوض المركزي للغرفة وضع قطبا كهربائيا واحدا في كل طبق.

سد الفجوة بين الغرفة وأطباق بتري لإنشاء الاستمرارية الكهربائية. باستخدام جسور Agros gel، قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر طاقة خارجي باستخدام مقياس M على التوالي لقياس التيار الكهربائي وتشغيل مصدر الطاقة. استخدم مقياس الحجم لقياس قوة المجال الكهربائي مباشرة عبر الحوض المركزي.

اضبط خرج مصدر الطاقة حسب الحاجة. ابدأ الآن وحدة الفاصل الزمني على نظام التصوير. في برنامج Axio vision ، حدد الاستحواذ متعدد الأبعاد وانقر فوق رؤية.

بالنسبة للقنوات، اختر القناة السادسة، وانقر على T للفاصل الزمني. اضبط إعدادات الفاصل الزمني للفاصل الزمني على دقيقة واحدة، واضبط المدة على ثماني ساعات في الإعدادات قبل وبعد حقول النقطة الزمنية، وحدد النقطة الزمنية قبل وبعد النقطة. الآن انقر فوق ابدأ واسمح للتجربة بالعمل للفترة الزمنية المطلوبة بعد الانتهاء من الفحص ، والمضي قدما في تحليل IHC.

كشف التحليل الحركي أنه في وجود 250 مللي فولت لكل ملليمتر DCEF غير المتمايزة غير المتمايزة تظهر محور جلفان شديد التوجيه وسريع نحو الكاثود عند شدة المجال هذه ، هاجر أكثر من 98٪ من الشخصيات غير المتمايزة غير المتمايزة لمدة ست إلى ثماني ساعات كاملة تم تصويرها من أجلها. في غياب A-D-C-E-F. لوحظت حركة عشوائية للخلايا.

نظرا لأن الخلايا الميتة لا تهاجر ، فهذا يشير إلى أنها تظل قابلة للحياة خلال هذه الفترة. في حالة غياب أو وجود A-D-C-E-F ، خضعت الأنماط الظاهرية المتمايزة لهجرة ضئيلة ، سواء في وجود وعدم وجود مجموعات فرعية من الخلايا المتمايزة أو عدم وجودها. عمليات ممتدة تميل إلى المحاذاة بشكل عمودي على اتجاه DCEF ، ولكن لم يلاحظ أي انتقال ملحوظ لجسم الخلية.

تحقق التلوين المناعي من أن الشخصيات غير القابلة للعب حافظت على التعبير الإيجابي عن عش علامة السلائف العصبية بعد ست ساعات من التعرض ل DC EF. في المقايسات التي تنطوي على الشخصيات غير القابلة للعب التي يتم تحريضها على التمايز إلى أنماط ظاهرية ناضجة ، تعبر غالبية الخلايا عن علامة الخلايا النجمية الناضجة البروتين الحمضي الليفي الدبقي أو GFAP بعد ست ساعات من التعرض ل DCEF. باتباع هذا الإجراء ، يمكن للمرء اكتساب نظرة مستقبلية حول الآليات الخلوية التي تشارك في تحويل المجال الكهربائي للتيار المباشر إلى حركة الخلية باستخدام نماذج الضربة القاضية الجينية.

أو سيدي ، على سبيل المثال.