كهرباء خالية من الحمض النووي متسلسل وعزل بروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الأحماض النووية الجاهزة لتفاعل PCR والبروتين التفاعلي مناعياً من عينة ما دون الحاجة إلى كهرباء أو بنية تحتية مخبرية. يبدأ عزل الأحماض النووية والبروتينات بخلط العينة مع الجوانيدين والثيوسيانات لتحليل العينة، ثم تمرير الخليط عبر المادة الممتصة في ماصة الاستخلاص. يتم تكرار هذه العملية خمس مرات، وبعد المرور الخامس والأخير عبر المادة الممتصة، يوضع الخليط في محلول استخلاص البروتين المنظم ويترك جانباً لعزل البروتين التفاعلي مناعياً.

بعد ذلك، يتم غسل المادة الماصة والأحماض النووية المرتبطة بها عن طريق تمرير 95% ethanol فوق المادة الماصة. ثم يتم تجفيف المادة الماصة والأحماض النووية المرتبطة بها عدة مرات عن طريق تمرير الهواء المحيط فوق المادة الماصة لمدة خمس دقائق. وتتمثل الخطوة النهائية لعزل الأحماض النووية الجاهزة لتفاعل PCR في استخلاص الأحماض النووية من المادة الماصة باستخدام 250 µL من tris أو محلول مائي مماثل آخر لعزل البروتين المناعي التفاعلي.

بعد خلط العينة مع محلول استخلاص البروتين، استخدم ماصة استخلاص ثانية ومرر الخليط فوق المادة الماصة 15 مرة. تتمثل الخطوة التالية في غسل المادة الماصة والبروتين المرتبط بها عن طريق تمرير ethanol بنسبة 95% فوق المادة الماصة لمرات عديدة. بعد ذلك، يتم تجفيف المادة الماصة والبروتين المرتبط بتمرير الهواء المحيط فوق المادة الماصة لمدة خمس دقائق.

تتمثل الخطوة النهائية من البروتوكول في استخلاص البروتين من المادة الماصة. وفي النهاية، تتيح ماصة الاستخلاص المستخدمة في هذا الإجراء عزل الأحماض النووية الجاهزة لتفاعل PCR والبروتينات ذات التفاعل المناعي دون الحاجة إلى الكهرباء. مرحباً، اسمي ديف باولوفسكي.

أنا باحث علمي أول في شركة Kubrick Incorporated في بوفالو، نيويورك، وسنتعلم اليوم تقنية تتيح عزل البروتينات والأحماض النووية معاً وبشكل متسلسل دون الحاجة إلى جهاز طرد مركزي أو جهاز مزج دوامي (vortex) أو أي معدات مختبرية خارجية أخرى. قبل البدء في تحلل العينات، تأكد من أن العينات في حالة سائلة. وإذا كانت العينة صلبة، مثل الأغذية أو البراز، فيجب تعليق العينة في وسط سائل مثل الماء أو المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (phosphate buffered saline).

امزج 500 µL من العينة مع 500 µL من غوانيدين ثيوسيانات بتركيز 6 M في أنبوب سعة 1.5 mL. بعد ذلك، اضغط على بصلة ماصة الاستخلاص لطرد الهواء المحيط. ثم اسحب عينة الـ 1 mL كاملةً إلى ماصة الاستخلاص عبر المادة الماصة عن طريق السماح للبصلة بالتمدد ببطء.

اقلب أداة الاستخلاص بحيث تنزلق حبيبات المادة المازة والعينة إلى البصلة. اطحن حبيبات المادة المازة مع العينة داخل البصلة، مع الحرص على عدم طرد العينة خارج ماصة الاستخلاص.

اقلب ماصة الاستخلاص، ثم أفرغ العينة في الأنبوب الأصلي سعة 1.5 milliliter. اسحب عينة الـ one milliliter بالكامل إلى داخل ماصة الاستخلاص، مع تمريرها فوق المادة الماصة بمعدل متوسط. مع الحرص على إبقاء المادة الماصة في عنق ماصة الاستخلاص، أفرغ العينة بالكامل في الأنبوب سعة 1.5 milliliter عن طريق الضغط على البصيلة.

كرر هذه العملية، بتمرير العينة فوق المادة الماصة أربع مرات إضافية ليصبح المجموع خمس تمريرات. بعد التمريرة الخامسة فوق المادة الماصة، قم بتفريغ عينة الـ 1 ml كاملة في 4 ml من محلول استخلاص البروتين في أنبوب مخروطي سعة 15 ml. اخلط الأنبوب عن طريق قلبه، ثم أغلقه واتركه جانباً لاستخدامه لاحقاً.

اغسل الأحماض النووية المعزولة بتمرير 1 mL من 95%ethanol فوق المادة الممتزة ثلاث مرات، مع إعادة الإيثانول إلى أنبوبه الأصلي. وعند التمرير النهائي، كرر عملية الغسل ثلاث مرات باستخدام 1 mL ثانٍ من غسول 95%ethanol. الخطوة التالية من الإجراء هي تجفيف المادة الممتزة، حيث يتم استرداد الأحماض النووية بشكل أفضل عندما تكون المادة الممتزة جافة.

أدرك أن هذه الخطوة مملة، ومع ذلك، إذا أتممتها ضمن الإطار الزمني الموصى به، فستكون نتائجك أفضل. اضغط على الماصة ثم حررها لمدة خمس دقائق.

قم بتمرير الهواء المحيط عبر ماصة الاستخلاص لتجفيف الأحماض النووية وطبقة المادة المازة، ثم امسح الإيثانول المتبقي من طرف ماصة الاستخلاص. وباستخدام منديل Kim wipe، استعد الأحماض النووية عن طريق تمرير 250 µL من 10 mM triss فوق المادة المازة خمس مرات. ويمكن استبدال منظم triss بأي محلول مائي مناسب آخر مثل PBS.

يحتوي المحلول الناتج على الأحماض النووية المستخلصة؛ ولإجراء استخلاص البروتين أولاً، اخلط العينة في دارئ استخلاص البروتين الذي تم تجهيزه مسبقاً عن طريق قلب الأنبوب، ثم مرر ما يقرب من 2 إلى 3 ملليلتر من هذه العينة ذات الـ 5 ملليلتر فوق المادة الماصة في ماصة استخلاص جديدة. قم بتفريغ كامل العينة في نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلتر، مع الحرص على إبقاء المادة الماصة في عنق ماصة الاستخلاص.

كرر هذه العملية، مع تمرير العينة فوق المادة الماصة 15 مرة. اغسل المادة الماصة والبروتين المرتبط بتمرير 1 mL من 95%Ethanol فوق طبقة المادة الماصة ثلاث مرات، مع تفريغ الإيثانول في أنبوبه الأصلي، ثم اغسل ثلاث مرات إضافية باستخدام 1 mL ثانٍ من محلول غسيل 95%ethanol.

الخطوة التالية من الإجراء هي تجفيف المادة المازبة مرة أخرى. وكما هو الحال مع الأحماض النووية، فإن استعادة البروتين تتم بشكل أفضل عندما يتم تجفيف المادة المازبة لفترة زمنية أطول.

اضغط على الممص ثم اتركه لمدة خمس دقائق، مع تمرير الهواء المحيط عبر ماصة الاستخلاص. ولتجفيف طبقة الممتز البروتيني، امسح الإيثانول المتبقي من طرف ماصة الاستخلاص. وباستخدام منديل Kim wipe، استعد البروتين عن طريق تمرير 250 µL من PBS فوق الممتز خمس مرات.

يمكن استبدال منظم PBS بأي محلول مائي مناسب آخر، مثل 10 millimolar tris بـ pH 6.8. ويحتوي المحلول الناتج على المحتوى البروتيني للعينة. وقد تم تضخيم جينات سموم الشيجا المرتبطة بسلالة E DL 9 33 من بكتيريا entero hemorrhagic e coli oh 1 5 7 H seven من خلال إجراء استخلاص للبروتين والأحماض النووية باستخدام ماصة الاستخلاص.

توجد جينات سم شيجا، سم شيجا واحد وسم شيجا اثنين، على عاثيات بكتيرية معتدلة تشبه Lambda وعاثيات بكتيرية معيبة تحت تحكم المحفز PR. يؤدي تنشيط استجابة SOS في بكتيريا e coli إلى تحفيز العاثية الأولية و/أو إنتاج السم. وفي هذه الحالة، تحدث زيادة كبيرة في تضخيم جين سم شيجا اثنين عند تحفيز استجابة SOS بواسطة mitomycin C مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة.

يشير هذا إلى تحفيز العاثيات الأولية وتكاثر جينوم العاثيات. البروتين المستخلص من تجارب عزل البروتين والحمض النووي الموضحة في الفيديو هو بروتين تفاعلي مناعيًا. تم وضع جزء البروتين المعزول على شرائط مقايسة التدفق الجانبي للفحص السريع لبكتيريا e coli O 1 57.

تُظهر الضوابط تحديداً إيجابياً في جميع العينات التي تحمل e coli oh 1 5 7 سواء مع تحفيز shiga toin أو بدونه، كما يتضح من وجود نطاقين أحمرين. كما تُظهر البيانات نتائج إيجابية لتلك العينات التي تحمل e coli oh 1 5 7 والتي تمت معالجة الأحماض النووية والبروتينات فيها باستخدام ماصة الاستخلاص. وتُبين هذه البيانات أن البروتين المعزول من كل عينة هو بروتين نشط مناعياً، مما أدى إلى استجابة إيجابية.

البروتين المعزول مناسب لعملية الفصل الكهربائي كما هو موضح هنا في هلام أكريلاميد بتركيز 8% مصبوغ بصبغة كوماسي ومحمل بـ BSA معزول باستخدام إيزوثيوسيانات غودينا بتركيز ستة مولار. وباستخدام عملية الاستخلاص والماصة والبروتوكول المرتبط بها، تكون الحركية الكهربائية للبروتين المعزول مطابقة لتلك الخاصة بعينات الضبط. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكنك تنفيذها في أقل من 20 دقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم واضح لكيفية عزل البروتينات والأحماض النووية من الجهاز البسيط. نشكرك على تخصيص الوقت لمشاهدة الفيديو الخاص بنا.