July 16th, 2012
نحن هنا وصف رواية عالية المحتوى فحص الالتهاب الناجم كيميائيا يهدف إلى التعرف على المناعة تغييري bioactives. لقد نجحنا في الجمع بين المجهر الآلي مع العرف مخطوطات البرمجيات المتقدمة تمكين الكمي الآلي للاستجابة التهابية، فضلا عن مزيد من معالجة البيانات وتحليلها، والتعدين، والتخزين.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء فحص النمط الظاهري لتحديد النشاط المعدل المناعي للمركبات باستخدام مقايسة التهاب أسماك الحمار الوحشي في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق توزيع يرقة أسماك الحمار الوحشي أولا إلى 384. تضاف المركبات التالية للوحة البئر التي سيتم فحصها إلى اليرقات للسماح باختراق الأنسجة.
ثم يضاف محلول كبريتات النحاس لإلحاق ضرر خاص بالأنسجة. أخيرا ، يتم استبدال المركبات وكبريتات النحاس بوسط جديد. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح مدى تدفق الكريات البيض الخاصة بالأنسجة بمرور الوقت من خلال تحليل بيانات الفحص المجهري في الجسم الحي في الوقت الفعلي.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالحث المتزامن للالتهاب في مئات الأفراد وبالتالي تمكن من الأتمتة التجريبية والتحليلية. ستظهر الإجراء كريستينا ويتمان ، طالبة دكتوراه من مختبري لفحص الذقن. قم بإعداد تزاوج جماعي بين أسماك AB المعدلة وراثيا مزدوجة متماثلة اللواقح والنوع البري ، وتجمع الأجنة عن طريق التفريخ الطبيعي وترفع 50 إلى 70 لكل صفيحة في E ثلاثة متوسطة عند 29 درجة مئوية إلى ثلاثة أيام بعد الإخصاب.
افحص جميع اليرقات تحت منظار مجسم فلوري لتعبير مراسل الفلورسنت ، والالتهاب التلقائي ، والتطور المناسب المرتبط بالعمر. بعد تحضير وسط الغربلة وإضافة 20 ميكرولترا إلى آبار 384 ، تنقل لوحة البئر يرقة مخدر واحدة في 74 ميكرولتر من الوسط إلى كل بئر. استخدام طرف ماصة تم قصه إلى حجم تجويف ملليمترين بطرف ماصة دقيقة مرن.
قم بتوجيه اليرقة في وضع جانبي داخل البئر قم بإجراء جميع خطوات معالجة السوائل التالية باستخدام محطة عمل معالجة السوائل الروبوتية لضمان المعالجة المتزامنة لجميع اليرقات للعلاج من تعاطي المخدرات. الماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات لخلط المركبات في طبق مخزون الأدوية. أضف 16 ميكرولترا من لوحة مخزون الدواء 7.5 × إلى لوحة الغربلة واخلطها خمس مرات بمعدل 10 ميكرولتر في الثانية.
قم بتغطية لوحة الغربلة بورق الألمنيوم واحتضانها لمدة ساعة عند 29 درجة مئوية. للحث على الجرح الكيميائي. أضف 10 ميكرولتر من محلول عمل كبريتات النحاس 120 ميكرومولار لكل منها.
حسنا ، اقبل خلط عناصر التحكم السلبية أربع مرات واحتضان مرة أخرى لمدة ساعة واحدة عند 29 درجة مئوية. اغسل الأجنة عن طريق إزالة وتبادل 80 ميكرولتر من الوسط من كل بئر مرتين بدءا من 90 دقيقة. بعد المعالجة الأولية للنحاس ، احصل على صور على مجهر آلي مقلوب باستخدام هدف فوركس.
اضبط مستوى Z الأولي بحيث تكون الكتلة العصبية من الخط الجانبي الخلفي الأيمن والأيسر مرئية وصور كل بئر مرة واحدة في الساعة. استخدام قنوات الجانب Brightfield الثلاثة وقنوات GFP في أربع مستويات بؤرية. يقوم برنامج عرض المختبر المخصص بإنشاء صور تركيز موسعة من أربعة مستويات بؤرية لكل قناة من القنوات.
ثم يتم دمج الصور لإنشاء صورة تراكب RGB نهائية. تحدد أداة التعرف على الأنماط الأورام العصبية داخل صور تراكب RGB وتنشئ منطقة اهتمام محددة تجريبيا حول الأورام العصبية يتم تسجيل الكريات البيض الفلورية الحمراء المحيطة بالأورام العصبية المصابة ، مما يؤدي إلى قراءة أولية للنسبة المئوية للمساحة التي تشغلها الكريات البيض أو شاحبة. في المتوسط ، يتم اكتشاف 95٪ من اليرقات بشكل صحيح ويمكن إخضاعها لاحقا لمزيد من معالجة البيانات.
يتم تقييم نجاح التجارب الفردية باستخدام خرائط الالتهاب أو خرائط العين. يتم ترميز البيانات الباهتة باللون الأخضر الفاتح ، مما يمثل مؤشرا التهابيا أوليا مرتفعا ، ويشير اللون الأسود إلى عدم وجود التهاب. تسمح هذه النظرة العامة السريعة بالتعرف السريع على التجارب الفاشلة ، والتي يمكن استبعادها بعد ذلك من مزيد من تحليل البيانات.
تظهرiMaps في الوقت 0.0 والوقت 0.5 بوضوح ما إذا كان ينبغي تضمين التجربة في مزيد من معالجة البيانات. تظهر أدوات التحكم النحاسية بظلال متفاوتة من اللون الأخضر ، بينما تظهر آبار التحكم في DMSO باللون الأخضر الداكن أو الأسود في الوقت 0.5. يتم حل الالتهاب تقريبا في أدوات التحكم النحاسية المشار إليها الآن بظلال داكنة من الأخضر أو الأسود لمعالجة الضوابط.
يتم حساب متوسط التكرارات المتماثلة ل 32 وحدة تحكم وحساب الانحراف المعياري. فقط. يتم تضمين نقاط البيانات ضمن انحرافين معياريين. يتم تعيين متوسط قيمة التحكم السلبي DMSO على الصفر ويتم تعيين أعلى متوسط PAOL للتحكم في النحاس على واحد يتم خطي كل مركب PAOL أو استقراءه إلى عناصر التحكم المعنية على اللوحة التجريبية.
يتم حساب متوسط البيانات الأولية الطبيعية من التجارب المكررة لإنتاج قراءة نهائية ، وهو مؤشر الالتهابات بسبب حل الالتهاب. بمرور الوقت ، يتم إجراء تركيب انحدار غير خطي أسي رتيب نحو الالتهاب الأولي. باستخدام هذه الصيغة حيث يكون الصفر هو مقياس الاستجابة الأولية في الوقت الذي يساوي صفرا ويرتبط واحد بميل الحجم بمرور الوقت لتوليد مساحة الميزة ، يتم تطبيق انحدار غير خطي ويقسم تحليل الكتلة مساحة الميزة إلى مناطق مميزة ، مما يسمح بالتحديد الآلي للمرشحين المثيرين للاهتمام من فئات تعديل المناعة المختلفة.
يتم عرض جميع المعلمات في مخطط 2D بناء على المعلمات ACE صفر و ace لواحد. تنشئ إجراءات معالجة البيانات صفحات ويب توفر نظرة عامة سريعة على النتائج ، بالإضافة إلى عرض مفصل ويطلبه المستخدم. تم أيضا دمج الروابط الناعمة لقواعد البيانات غير المتجانسة والبيولوجية والكيميائية الأخرى ذات الصلة لتوفير مورد قيم للدراسات المقارنة والجديدة من خلال هذه الإجراءات الروتينية.
تم تعيين معايير البيانات المناسبة والمعلومات الوصفية لتخزين هذه البيانات على المدى الطويل في شاشة تجريبية ، وتم إجراء تحليل في مكتبة تضم 640 مركبا نشطا بيولوجيا معروفا معتمدا من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية للتأثير على تقدم البدء أو حل الاستجابة الالتهابية المحببة. بناء على التأثيرات الملحوظة ، تم تصنيف أربعة أنواع من الأنماط الظاهرية المعدلة للمناعة والتي قد تكون مؤشرا على طرق مختلفة من العمل ، ومضادة للالتهابات ، ومضادة للحل ، ومؤيدة للالتهابات ، ومقاومة للحل. 45 من أصل 640 مركبا لها تأثيرات كبيرة مضادة للالتهابات عن طريق خفض مؤشر الالتهابات الأولي إلى 50٪ أو أقل.
ضمن هذه الفئة ، تم العثور على ستة مركبات تنتمي إلى الفئة الدوائية للأدوية المضادة للالتهابات الحسنة. تأكيد صحة هذا النهج ، بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أتمتة الفحص الظاهري في الجسم الحي لنشاط المركب المعدل المناعي إلى حد كبير ، مما يسمح بالحصول على البيانات المتسقة وتحليلها في سياق حيواني كامل.
تقدم هذه الدراسة تحليلًا للالتهاب المحدث كيميائيًا عالي المحتوى باستخدام يرقات أسماك الزرد لتحديد المواد النشطة بيولوجيًا المانعة للالتهابات. تجمع الطريقة بين التصوير المجهري الآلي والبرمجيات المخصصة لتحديد الاستجابات الالتهابية وتحليل البيانات.
This automated high-content inflammation assay in zebrafish enables phenotypic screening for immune-modulatory compounds in a whole-animal context, supporting early target validation and mechanistic de-risking. By quantifying leukocyte recruitment in real time, the method provides predictive confidence in compound effects on inflammatory pathways, facilitating go/no-go decisions in discovery pipelines. The integration of robotic liquid handling and custom analytics supports scalable, reproducible data generation for portfolio triage.
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, delivering functional immune response data that informs compound prioritization before preclinical investment.