تنقية وتجميع على البروتين اميلويد السلائف المجال بين الخلايا

الهدف من هذا الإجراء هو تنقية مجال بروتين سلائف الأميلويد داخل الخلايا ، المعروف أيضا باسم مقوم نظم القلب ومزيل الرجفان القابل للزراعة ، وتقديم بروتوكول للتجميع الحراري وتوصيف التصنيف الدولي للأمراض A عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعبير أولا عن اندماج GST ل A ICD في البكتيريا. بعد ذلك ، يتم تنقية بروتين G-S-T-A-I-C-D المشقوق بالثرومبين لفصل ضريبة السلع والخدمات عن مقوم نظم القلب ومزيل الرجفان القابل للزراعة وإزالة ضريبة السلع والخدمات.

ثم يتم تحفيز التجميع الحراري ل ICD. أخيرا ، يتم تصوير مجاميع التصنيف الدولي للأمراض باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر أنه يمكن تنقية مقوم نظم القلب ومزيل الرجفان القابل للزراعة إلى التجانس بكمية كافية للتحليل الكيميائي الحيوي والفيزيائي الحيوي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، والتي تتطلب خطوات كروماتوغرافيا معقدة هي أنها عالية النقاء وقابلة للذوبان. يمكن عزل مقوم نظم القلب ومزيل الرجفان القابل للزراعة على سطح الطاولة باستخدام الكواشف والمعدات القياسية. يعد تصنيف مقوم نظم القلب ومزيل الرجفان القابل للزراعة الذي ينتجه هذا البروتوكول مناسبا لمزيد من التوصيف الكيميائي الحيوي والفيزيائي الحيوي.

وسيكون توضيح الإجراء أمينة تي. سيوضح الدكتور أندريس أوبيرر ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه السابق في مختبري ، كيفية إجراء التصوير المجهري للقوة الذرية ل A ICD للتعبير عن المجال المؤتلف A PP داخل الخلايا أو A ICD. ابدأ بخلايا BL 21 التي تحولت مع ناقل pgx 41 ، حيث تؤوي الإنسان A مزيل الرجفان القابل للزراعة المدمجة في الطرف C من ضريبة السلع والخدمات مع مستعمرة واحدة ، وتلقيح 10 مل من مرق LB بالأمبيسلين واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي في صباح اليوم التالي.

احتضن 400 مل من LB ampicillin في قارورة سعة لتر واحد مع خمسة ملليلتر من الثقافة الليلية. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.4 إلى 0.6. سيستغرق هذا عادة من ساعتين إلى 2.5 ساعة للحث على التعبير عن G-S-T-A-I-C-D.

نضيف 0.4 ملليمولار من IPTG واحتضننا 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي لمدة خمس ساعات. الطرد المركزي للخلايا عند 6 ، 000 مرة G لمدة 15 دقيقة من أربع درجات مئوية وتخزين الحبيبات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد تحضير التحلل والمخزن المؤقت ورمي البكتيريا على الجليد ، أضف 20 مل من المخزن المؤقت إلى الحبيبات واستخدم مزيجا من الدوامة والتواجد على الجليد باستخدام ماصة جيدا.

ريس بتعليق الحبيبات البكتيرية ، وتمرير المحلل البكتيري المعلق من خلال مستحلب مبرد مسبقا أو مكبس فرنسي. عند 30،000 رطل لكل بوصة مربعة ، قم بتمرير المحللة عبر المستحلب مرة ثانية وجمع المحللة في أنبوب 50 مليلتر مبرد مسبقا. جهاز الطرد المركزي المحللة 15 ، 000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

افصل وانقل supinate إلى أنبوب مبرد مسبقا سعة 50 مل. أضف 500 ميكرولتر من ملاط 50٪ من الجلوتاثيون نشأ. قم بالتدوير لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية أثناء دوران العينة.

قم بعمل مخزن مؤقت للشطف بعد الحضانة. صب المحللة والملاط في عمود كروماتوغرافيا البوليسترين القابل للتصرف بحجم خمسة بوصات مع مرشحات الدورة. اغسل العمود خمس مرات بثلاثة ملليلتر من PBS.

قم بتغطية الجزء السفلي من العمود وأضف 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة ، ومخزن الشطف. قم بتغطية الجزء العلوي من العمود وقم بتدويره لمدة خمس دقائق من درجة حرارة الغرفة. اجمع الوزن المبكر في أنبوب نفايات صغير مبرد سعة 1.5 مل.

كرر الشطف مرتين أخريين. غسيل الكلى في غشاء غسيل الكلى المقطوع بوزن جزيئي 10 ، 000 في أربعة لترات من PBS بين عشية وضحاها من أربع درجات مئوية في اليوم التالي. غسيل الكلى مقابل أربعة لترات إضافية من PBS عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

قم بإزالة البروتين من كاسيت غسيل الكلى وقم بإجراء فحص قياس البروتين لتحديد عائد G-S-T-A-I-C-D. سيؤدي التنقية النموذجية من 400 مل من الثقافة إلى غلة تزيد عن 20 ملليغرام من البروتين المنقى بتركيزات من 10 إلى 20 ملليغرام لكل ملليلتر. قم بتقطيع البروتين إلى 200 ميكرولتر ، وحصص ، وتجميد 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لتحرير جهاز مزيل الرجفان القابل للزراعة من ذوبان ضريبة السلع والخدمات ، 200 ميكرولتر من G-S-T-A-I-C-D المنقى وإضافة 20 إصدارا صغيرا من وحدة واحدة لكل ميكرولتر من الثرومبين تحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي ، قم بمسح أي مادة مجمعة عن طريق الطرد المركزي عند 20،000 مرة G لمدة 30 دقيقة من أربع درجات مئوية. انقل SUPINATE إلى أنبوب دقيق مبرد مسبقا لإزالة ضريبة السلع والخدمات والثرومبين. أضف 50 ميكرولترا من ملاط الجلوتاثيون آرو 50٪ و 50 ميكرولتر ، 50٪ p و wino zaine aro slurry على التوالي.

احتضن مع الدوران لمدة خمس دقائق من درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لترسيب الخرزات الزراعية وإزالة supinate في أنبوب جديد. استخرج ضريبة السلع والخدمات أربع مرات أخرى باستخدام الجلوتاثيون.

يقوم Aros بإجراء اختبار كمية البروتين على خمسة ميكرولترات من مقوم نظم القلب ومزيل الرجفان القابل للزراعة المنقى للأمراض A. الغلة النموذجية من ثقافة 400 ملليلتر هي 50 إلى 100 ميكروغرام بتركيز 0.2 إلى 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر. بعد تخفيف التصنيف المزيل للأمراض المحضرة حديثا في PBS إلى تركيز 0.1 ملليغرام لكل مليلتر ، تم تحفيز التجميع الحراري عن طريق احتضان العينات عند 43 درجة مئوية عند 800 دورة في الدقيقة في شاكر ساخن لمدة 48 ساعة.

خفف العينة 20 ضعفا بالماء منزوع الأيونات وضع ميكرولترين على شق طازج. الميكا يجفف العينة في الجفاف بين عشية وضحاها لتصور الفحص المجهري للقوة الذرية المجمعة يستخدم مقوم نظم القلب وزرعة الرجفان القابل للزراعة في وضع التنصت مع الذهب goated. ناتئ نيتريد حاد صغير بنصف قطر طرف اسمي يبلغ نانومتر.

اتساع التنصت النموذجي أثناء التصوير ، من 10 إلى 20 نانومتر عند تردد الرنين للناتئ. يظهر هنا التعبير والإثراء النسبي ل G-S-T-A-I-C-D. بعد التحلل ، توجد غالبية بروتين الاندماج في الجزء القابل للذوبان ، وبالتالي لا يلزم الاستخراج من أجسام التضمين.

المادة المشار إليها من عمود الجلوتاثيون الصاعد أكبر من 95٪ نقية. في المستحضر الموضح هنا ، كان تركيز البروتين المشار إليه من العمود 14.5 ملليغرام لكل مليلتر ، وكان العائد 22 ملليغرام. أدى انقسام 200 ميكرولتر من هذا المستحضر بين عشية وضحاها مع 20 وحدة من الثرومبين إلى انقسام ما يقرب من 100٪ من بروتين الاندماج.

كمية الثرومبين المستخدمة منخفضة بما يكفي بحيث لا يمكن اكتشافها بواسطة كوماسي. أدى التلوين الأزرق وإزالة الثرومبين وضريبة السلع والخدمات إلى بعض فقدان المواد. ومع ذلك ، فقد كان أكبر من 90٪ نقيا مع عائد في هذا الإعداد يبلغ 70 ميكروغراما من مقوم نظم القلب ومزيل الرجفان القابل للزراعة بتركيز 0.35 ملليغرام لكل مليلتر.

عادة ما تكون مجاميع التصنيف الدولي للأمراض ، التي تم تصويرها بواسطة FM غير متبلورة من الستيرويد ويتراوح حجمها من 50 إلى 100 نانومتر. لا يمكن اكتشاف المواد المجمعة عند إضافة كمية متساوية المولار من مرافق UBI Quillin واحد إلى تفاعل التجميع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية EICD يحفز تجميعه وخليج تجميع الصورة A-F-M-E-I-C-D.

يمكن تطبيق المنقى بهذه التقنية على طرق أخرى مثل تشتت الضوء ومقايسات مصيدة الترشيح للإجابة على الأسئلة المتعلقة بتأثير المرافقين الجزيئيين على تجميع EACD.