العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل نوى الخلايا العضلية القلبية من أنسجة مأخوذة بعد الوفاة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجانس الأنسجة باستخدام مجانس مسباري وماسحة زجاجية، تليها عدة خطوات ترشيح. وتتمثل الخطوة الثانية في عزل الجزء النووي عن الأجزاء الخلوية الأخرى عن طريق طرد مركزي بالترسيب الكثافي.

بعد ذلك، يتم وسم نوى الخلايا العضلية القلبية مناعياً باستخدام جسم مضاد مشتق ضد PCM1. وتتمثل الخطوة النهائية في عزل نوى الخلايا العضلية القلبية الموصومة عن طريق فرز الخلايا المنشط فلورياً. وفي النهاية، وقبل إجراء المزيد من المعالجات اللاحقة، يتم التأكد من نقاء نوى الخلايا العضلية القلبية من خلال إعادة تحليل أجزاء النوى التي تم فرزها.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تحليل نوى الخلايا العضلية القلبية بكفاءة متساوية سواء من الأنسجة الطازجة أو الأنسجة المؤرشفة والمجمدة وبإنتاجية عالية. وتعتبر الدراسات القائمة على DNA في الخلايا العضلية القلبية صعبة للغاية لعدة أسباب؛ أولاً، لأن الخلايا العضلية القلبية تشكل حوالي 20 30% فقط من خلايا القلب.

علاوة على ذلك، فهي تحتوي على أنوية بدرجة كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا العضلية القلبية تكون متعددة الصيغ الصبغية بدرجة كبيرة. وتتجاوز الطريقة الموصوفة هنا كل هذه العقبات.

قبل البدء في الإجراء، قم بطلاء أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق بـ 10 milliliters من محلول طلاء مكون من 1%BSA بالإضافة إلى PBS. بعد تدوير الأنابيب لمدة 30 دقيقة، قم بإزالة محلول الطلاء واتركها لتجف في الهواء.

ابدأ إجراء عزل النوى القلبية باستخدام المشرط لتشريح البطين الأيسر من قلب فأر مجمد تجميداً سريعاً. قم بتقطيع العينة المشرحة إلى قطع صغيرة، ثم انقل قطع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter مملوء بـ 15 milliliters من محلول التحلل (lysis buffer). بعد ذلك، قم بتجانس أنسجة القلب باستخدام مجانس مسباري بسرعة 24,000 RPM لمدة 10 ثوانٍ، ثم خفف التجانس بحجم مساوٍ من محلول التحلل ليصل الإجمالي إلى 30 milliliters. انقل التجانس إلى مجانس زجاجي (glass down homogenizer) باستخدام ثماني ضربات بمدقة ذات خلوص كبير لتحرير النوى.

بعد ذلك، قم بتمرير النوى الخام. يتم العزل أولاً عبر مصفاة خلايا بمسامية 100 micron، ثم عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 micron في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter. الآن، قم بطرد عينة النوى الخام المعزولة مركزياً لمدة 10 دقائق عند 700 ×g ودرجة حرارة أربع درجات Celsius.

اقلب الأنبوب لإزالة السائل الطافي بعناية، ثم امسح الجزء الداخلي من الأنبوب بمنشفة ورقية، مع الحرص على عدم تعريض كتلة النوى للاهتزاز. اسحب المحلول بالماصة للأعلى وللأسفل عدة مرات لإعادة تعليق النوى الخام.

قم بالعزل في 5 milliliters من محلول السكروز المنظم، ثم أضف 25 milliliters إضافية من محلول السكروز المنظم إلى معلق النوى. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من محلول السكروز المنظم المُحضّر حديثاً إلى أحد أنابيب الطرد المركزي الفائق المغلفة والمحضرة مسبقاً. ثم قم بعناية بوضع محلول راسبة النوى المُعاد تعليقها فوق طبقة المحلول المنظم.

بعد موازنة الأنبوب في دوّار حر الحركة، ضع الدوّار في جهاز طرد مركزي عالي السرعة وقم بتدوير عينة النوى لمدة 60 دقيقة عند 13,000 ×g ودرجة حرارة أربع درجات Celsius. عند اكتمال عملية التدوير، أخرج الأنابيب بعناية من الدوّار واقلبها مرة أخرى. للتخلص من السائل الطافي، امسح البقايا المتبقية من داخل الأنبوب باستخدام مناديل ورقية كما سبق، ثم أعِد تعليق ركازة النوى في واحد milliliter من محلول تخزين النوى.

قبل البدء في إجراء الصبغ المناعي، انقل مقدار 20 µL من عينة النوى إلى أنبوب فكس. أضف 980 µL من محلول تخزين النوى إلى هذه العينة وقم بتسمية الأنبوب "الضابط السلبي". الآن، أضف الجسم المضاد anti PCM one إلى عينة النوى وأنابيب الضابط السلبي بتخفيف قدره 1:500.

بعد ذلك، يتم تحضين كلا الأنبوبين عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، وبعد غسل الأنابيب باستخدام محلول تخزين النوى والتخلص من الطافي، يتم إعادة تعليق رواسب النوى في 1 mL آخر من محلول تخزين النوى.

بعد ذلك، أضف جسماً مضاداً ثانوياً فلورياً مضاداً للأرانب إلى عينات الخلايا بتخفيف 1:100، وقم بحضنها عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. وبعد غسل الأنابيب باستخدام محلول حفظ النوى، أعد تعليق الراسب في 1 mL من محلول حفظ النوى لإجراء الفرز والتحليل بالتدفق الخلوي، وبعد طلاء أنابيب تجميع النوى باستخدام BSA وPBS كما في بداية الفيديو، ابدأ بترشيح العينة والضابط السلبي من خلال مصافي خلايا فردية بحجم 30 micron. وقبل التحميل مباشرة، أضف صبغة DNA.

أضف تخفيفًا بنسبة 1 إلى 500 لتحديد تجمعات النوى. قم بتحميل العينة الضابطة السلبية على جهاز قياس التدفق الخلوي. استخدم معاملات التشتت الأمامي والجانبي لوضع البوابة الأولى لتحديد نوى القلب، بشكل مشابه لمخطط النقاط (DOT plot) الموضح هنا.

بعد ذلك، استخدم معلمات التشتت الأمامي وعرض نبضة التشتت الأمامي لإنشاء بوابة ثانية حول النوى المنفردة، بشكل مشابه لمخطط DOT الموضح هنا. الآن، قم بتحميل العينة المحددة مناعيًا وضع البوابة الثالثة لتمييز نوى الخلايا العضلية القلبية الموجبة لـ PCM one عن نوى الخلايا غير العضلية القلبية السالبة لـ PCM one. استخدم صبغة الحمض النووي النووي لتحليل محتوى DNA وإجراء تحليل للدورة الخلوية بشكل مشابه للتحليل الموضح في هذا المدرج التكراري.

بعد فرز النوى بناءً على إيجابية PCM one، توضع النوى المفرزة على الثلج، ويُعاد تحليل جزء من كل عينة مفرزة لتحديد درجة نقاء الفرز. وأخيرًا، تُرسّب النوى المفرزة في أنابيب التجميع عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة بسرعة 1500 ×g ودرجة حرارة 4 °C. وبعد التخلص من السوائل الطافية، تُعلق كتل النوى في محلول منظم متوافق مع التطبيق المطلوب لاحقًا.

في هذا الشكل الأول، صُبغ قلب فأر بالغ بصبغة نووية وأجسام مضادة ضد PCM one، وعامل نسخ قلب الفأر NKX2.5، وسلسلة الميوسين الثقيلة أو MHC. يظهر هنا تكبير لصورة التراكب من الشكل السابق. لاحظ كيف أن النوى المحددة بـ PCM one باللون الأبيض تعبر عن عامل النسخ NKX2.5 باللون الأحمر، وهي محاطة بسيتوبلازم الخلايا العضلية القلبية باللون الأخضر.

توضح هذه البيانات مجتمعة الدقة التي يحدد بها صبغ PCM one نوى الخلايا العضلية القلبية. يبرز المربع الداخلي نمط صبغ PCM one فوق النووي في نوى الخلايا العضلية، كما تشير الأسهم كذلك في التجربة الموضحة في الأشكال الثلاثة التالية، حيث صبغَت نوى القلب المعزولة بصبغة DNA المسماة DRAC five، وبأجسام مضادة ضد PCM one. وهنا، وفي تراكب الشكلين السابقين، تسلط الأسهم الضوء مرة أخرى على نمط صبغ PCM one فوق النووي في نوى الخلايا العضلية القلبية المعزولة.

يوضح هذا المخطط النقطي أن ما يقرب من 30% من النوى المعزولة بهذه الطريقة هي نوى خلايا عضلية قلبية، كما يتضح من وسم PCM one الخاص بها. وأخيرًا، وكما توضح هذه الرسوم البيانية، فإن نوى الخلايا العضلية القلبية للفئران هي في الغالب ثنائية الصيغة الصبغية (diploid) كما يشير ذروة 2N، وهناك مجموعة فرعية صغيرة فقط رباعية الصيغة الصبغية (tetraploid) كما تشير ذروة 4N الأصغر. ومن مميزات هذه التقنية أنه يمكن تكييفها بسهولة لأنواع أخرى.

أما بالنسبة للبشر.