Name: العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: تعلم عزل نوى خلايا القلب من الأنسجة بعد الوفاة باستخدام التجانس والطرد المركزي وفرز الخلايا المُنشَّطة بالفلورة. هذه الطريقة تضمن نقاءً عاليًا للنوى المعزولة لدراسة وظائف القلب.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نعترف مارسيلو تورو للمساعدة مع التدفق الخلوي. وأيد هذه الدراسة السويدية القلب والرئة مؤسسة، مفوضية الاتحاد الأوروبي &quot;CardioCell&quot; FP7، السويدية مجلس البحوث والتأمينات AFA ومؤسسة آنا ليند. وأيد OB بواسطة جمعية الألمانية للبحوث.

1. العزلة من نوى القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب منبذة فائقة معطف (أنابيب الطرد المركزي بيكمان # 363664) مع 10 مل من 1٪ حل طلاء جيش صرب البوسنة / برنامج تلفزيوني. تتويج الأنابيب والسماح لهم بالتناوب لمدة 30 دقيقة في محور دوار أنبوب. إزالة حل طلاء، والسماح مطلوب من أجهزة الطرد المركزي أنابيب الهواء الجاف (أنبوب واحد في قلب فأر لتحليل قلوب ماوس واحدة، قلوب بالتناوب الماوس تصل إلى 5 أو 1 غرام من أنسجة القلب من مختلف الأنواع ويمكن (على سبيل المثال الإنسان) يمكن معالجتها في أنبوب واحد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية على الجليد. تشريح البطين الأيسر من القلب الماوس طازجة أو مجمدة مبكرة مع مشرط. علما، هو الأمثل لهذا البروتوكول قلب فأر ولكن يمكن أيضا أن تتكيف مع الفئران أو قلب الإنسان. بدلا من ذلك، استخدام ما يصل الى 1 غرام من أنسجة القلب من مختلف الأنواع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم عينة في مقصورات صغيرة مع مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القطع الأنسجة في أنبوب 50 مل مليئة الصقر 15 مل من عازلة تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجانسأنسجة القلب مع T-25 الخالط مسبار الترا Turrax (IKA) في 24000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع جناسة مع حجم مساو من عازلة تحلل إلى 30 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام douncer زجاج (40 مل) إلى مزيد من التجانس والأنسجة وخالية من النواة. أداء 8 السكتات الدماغية مع مدقة تخليص كبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير نواة عزل الخام من خلال 100 ميكرون و 70 ميكرومتر شبكة النايلون مصفاة خلية دينار بحريني (العلوم البيولوجية)، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار على عزل نواة الخام في جهاز للطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بعناية بواسطة أنابيب للقلب ومسح داخل أنبوب مع منشفة ورقية. يجب الحرص على عدم تعكير صفو كريات النوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل نوى الخام عزل في 5ml من عازلة السكروز بواسطة pipetting الحل عدة مرات صعودا ونزولا. إضافة مزيد من 25 مل من عازلة السكروز إلى بيليه المنحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من عازلة السكروز الطازجة إلى أنبوب منبذة فائقة المغلفة (انظر الخطوة 1.1). &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب بعناية المضافة 10 مل من عازلة السكروز مع بيليه نوى معلق في حل العازلة السكروز من الخطوة 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق التوازن في أنابيب الطرد المركزي قبل وضعها في الدوار مجانا JS13.1 يتأرجح ووضع الدوار في جهاز الطرد المركزي عالية السرعة (بيكمان أفانتي S-25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور عينة النوى في 13000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تدور انتهت، وإزالة الأنابيب بعناية من الدوار وتجاهل طاف بواسطة أنابيب للقلب والقضاء على ما تبقى من الحطام داخل الأنابيب مع منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل كريات النوى في 1ml من المخزن تخزين النوى (NSB زائد عازلة). ملاحظة: NSB زائد يحتوي على 1.5 ملي السبيرمين باعتبارها عامل استقرار الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في الخطوة 2.1، المناعية من نوى cardiomyocyte. </li></ol> 2. المناعية عن التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سيطرة سلبية على المناعية. يأخذ قسامة من خارج ميكرولتر 20 من عينة نوى وDD 980 ميكرولتر من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مادة مضادة للمحيط بالمريكز 1 الأضداد (أرنب المضادة للPCM-1، الأجسام المضادة أطلس) لعينة النوى في التخفيف من 1:500 إلى نوى immunolabel cardiomyocyte. إضافة الجسم المضاد isotype في تخفيف نفس الأجسام المضادة لمكافحة PCM-1 لسيطرة السلبية، التي أعدت في الخطوة 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان سيطرة السلبية وأنبوب عينة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل سيطرة السلبية وعينة على الأقل مرة واحدة مع جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت (تدور أسفل الأنابيب في جهاز الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وحل كريات النوى في 1 مل من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية فلوري (FITC أو APC) إلى سيطرة السلبية وأنبوب عينة في التخفيف من 1:1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان سيطرة السلبية وأنبوب العينة في درجة مئوية 4 ل 1 ح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل سيطرة السلبية وعينة على الأقل مرة واحدة مع جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت (تدور أسفل الأنابيب في جهاز الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وحل كريات النوى في 1 مل من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في تحليل تدفق cytometric والفرز. </li></ol> 3. تدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب معطف جمع النوى (فالكون 15 مل) مع حل جيش صرب البوسنة / PBS 1٪ قبل البدء في التدفق الخلوي الفرز كما هو موضح في الخطوة 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية العينة ومراقبة سلبية من خلال مصفاة ميكرومتر الخلية 30 و تحميل لأول مرة سيطرة السلبية على تدفق عداد الكريات دينار بحريني (تدفق). تعريف البوابة الأولى والثانية لتحديد نوى و singlets (نواة واحدة)، استنادا إلى الأمام مبعثر (FSC)، إلى الأمام عرض نبض مبعثر (FS نبض العرض) والتشرذم الجانب (SSC) (الشكل 2a و ب). ويمكن إضافة الحمض النووي وصمة عار (DRAQ5 (1:500)) إلى نموذج يساعد على التعرف على سكان نوى في البداية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عينة immunolabeled وتحديد بوابة ثالثة لعزل نواة cardiomyocyte (PCM-1-positve) من غير cardiomyocyte نوى (PCM-1-سلبية). بدء الفرز(الشكل 2C ود). </li></ol> اختياري: من أجل تحليل محتوى الحمض النووي (الصيغة الصبغية) وإجراء تحليل دورة الخلية إضافة الحمض النووي المناسب وصمة عار على النوى (على سبيل المثال هويشت 33342 أو DRAQ5) (الشكل 2E). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الفرز التدفق الخلوي، ووضع نواة على الجليد وإعادة تحليل لتحديد نقاء فرز (الشكل 3A و ب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار نوى فرزها في أنابيب جمع في 1500 XG في جهاز للطرد المركزي المبردة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل كريات النوى في منطقة عازلة متوافقة مع تطبيق المصب. </li></ol> 4. ممثل النتائج ويمكن تقييم التشكل نوى وسلامتها من قبل بقع الحمض النووي وتصور بواسطة المجهر (الشكل 1). ويمكن تقييم نجاح PCM-1 وضع العلامات بواسطة المجهر epifluorescence والتدفق الخلوي (الشكل 1 والشكل 2C ود). PCM-1-positiهاء، وينبغي أن يفصل تماما من السكان سلبية عن بعضها البعض (الشكل 2C ود). في البطين الأيسر الفئران يجب أن حوالي 30٪ من جميع نوى أن تكون نواة cardiomyocyte (الشكل 2D). ويمكن فرز نقاء يتم تقييمها من خلال إعادة تحليل نوى فرزها (الشكل 3A و ب). وينبغي على حد سواء السكان نواة لديها نقاء فرز تتجاوز 95٪. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> الشكل 1. PCM-1 يحدد الأنوية cardiomyocyte. ملطخة نوى القلب (أ) مع الأجسام المضادة للPCM-1 (ب) وNkx2.5 (ج) في قلب فأر بالغ. (د) وتحيط PCM-1-وصفت من قبل نواة السيتوبلازم cardiomyocyte (ميوسين الثقيلة سلسلة (MHC))، وأعرب عن عامل النسخ Nkx2.5، وتوثيق وتحديد دقيق للنوى cardiomyocyte بواسطة تلطيخ-1 PCM (الحانات نطاق 20 ميكرون و 10 ميكرومتر (د، أقحم)). (ه) العزلات نوى القلب تصور مع الحمض النووي وصمة DRAQ5. (و و ز) Cardiomyocوصفت نوى yte مع الأجسام المضادة ضد PCM-1 (مقياس شريط 10 ميكرون). علما، ونمط تلطيخ epinuclear من PCM-1 في نواة خلية عضلية في قسم الأنسجة ومعزولة في نوى (سهام). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> الشكل 2. فرز تدفق cytometric من نوى cardiomyocyte. (أ) يتم تحديد نوى القلب بواسطة المبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC). (ب) من بوابة ثانية يحدد نواة واحدة من قبل FSC ونبض FS عرض 5. (ج، د) النابضة نيون يسمح للفصل من نوى cardiomyocyte (PCM-1-إيجابي)، وغير cardiomyocyte-(PCM-1-سلبية) نواة من أنسجة القلب. (ه) cardiomyocyte الفأر هي في معظمها (&gt; 80٪) مضاعفا (2N)، فقط مجموعة فرعية صغيرة من رباعي الصيغة الصبغية (4N) 6. علما، العضلية الإنسان تحتوي على تردد أعلى من نوى تعدد الصيغ الصبغية (&gt; 2N) 7،8. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <stroنانوغرام&gt; الشكل 3. تحليل نقاء فرز النوى cardiomyocyte وغير cardiomyocyte. إعادة تحليل فرز النوى غير cardiomyocyte (أ) و cardiomyocyte (ب). على حد سواء من السكان وتظهر نقاء فرز تتجاوز 99٪.

<ol><li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li>
<li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li>
<li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content%2C+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li>
<li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content%2C+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts%3A+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li>
<li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li>
<li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li>
<li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2-5%28eGFP%2Fw%29+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li>
<li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28(2009).</li>
<li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li>
<li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li>
<li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914(2008).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تحديد دقيق للنوى cardiomyocyte هو أمر حاسم لتحليل عمليات التجدد في عضلة القلب 2،3. تقوم أساسا التقنيات التقليدية لعزل العضلية من الأنسجة جديدة على الهضم الأنزيمي من البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وتنقية لاحق من الخلايا الخلالي عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة. لا يمكن أن يؤديها تنقية مزيد من العضلية الحية من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) بواسطة الوسم المناعي مع علامات سطح مثل سيربا 9 أو الأصباغ الميتوكوندريا 10، يمكن تحديد العضلية الثابتة علام...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1. تحلل الواق </td></tr><tr><td> اسم كاشف </td></tr><tr><td> 0،32 م السكروز </td></tr><tr><td> تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8) </td></tr><tr><td> 5 مم CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 خلات ملي المغنيسيوم </td></tr><tr><td> 2.0 مم EDTA </td></tr><tr><td> 0.5 مم EGTA </td></tr><tr><td> 1 مم DTT </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2. السكروز العازلة </td></tr><tr><td> اسم كاشف </td></tr><tr><td> 2.1 متر السكروز </td></tr><tr><td> تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8) </td></tr><tr><td> 5 خلات ملي المغنيسيوم </td></tr><tr><td> 1 مم DTT </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 3. نوى عازلة للتخزين (جهاز الأمن القومي زائد) </td></tr><tص&gt; <td> اسم كاشف </td></tr><tr><td> 0،44 م السكروز </td></tr><tr><td> تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 ملم بوكل </td></tr><tr><td> 10 ملي MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5 ملم السبيرمين </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكواشف والمعدات </td><td> شركة </td></tr><tr><td> Isotype أرنب مفتش رقاقة الصف، # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للPCM-1 الأضداد، # HPA023374 </td><td> الأجسام المضادة أطلس </td></tr><tr><td> حمار ثانية. الأجسام المضادة، المضادة للأرنب ترتيب 488 فلور، # A-21206 ثانية أو ما يعادلها. فلوري الأضداد </td><td> الحياة تكنولوجيز </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> مصافى الخلية 30 ميكرون، ميكرومتر 70 و 100 ميكرون </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td></tr><tr><td> زجاج douncer (40 مل)، والمدقه &quot;L&quot; </td><td> VWR (ويتون للصناعات المحدودة) </td></tr><tr><td> T-25 الترا Turrax الخالط </td><td> IKA ألمانيا </td></tr><tr><td> أداة تفريق S25 N-18 G </td><td> IKA ألمانيا </td></tr><tr><td> بيكمان أفانتي جهاز طرد مركزي </td><td> بيكمان كولتر </td></tr><tr><td> صقر أنابيب 15 مل و 50 مل </td><td> VWR </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي بيكمان # 363664 </td><td> بيكمان كولتر </td></tr><tr><td> JS13.1 مجانا الدوار يتأرجح </td><td> بيكمان كولتر </td></tr><tr><td> تدفق عداد الكريات </td><td> بيكمان كولتر </td></tr><tr><td> أنبوب الدوار </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

العزلة نوى cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

وقد تم تحديد نوى cardiomyocyte تحديا في المقاطع النسيجية حيث أن معظم استراتيجيات الاعتماد فقط على البروتينات علامة حشوية 1. أحداث نادرة في myocytes القلب مثل انتشار وموت الخلايا المبرمج يحتاج الى تحديد دقيق للنواة خلية عضلية قلبية على تحليل تجديد الخلوية في التوازن وفي الحالات المرضية 2. هنا، ونحن نقدم وسيلة لعزل نواة cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة بواسطة الترسيب كثافة والوسم المناعي مع أجسام مضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) واللاحقة الفرز التدفق الخلوي. هذه الاستراتيجية تسمح للتحليل إنتاجية عالية والعزلة مع الاستفادة من العمل بشكل جيد على قدم المساواة في الأنسجة الطازجة والمجمدة المواد الأرشيفية. هذا يجعل من الممكن لدراسة المواد التي تم جمعها بالفعل في biobanks. هذه التقنية قابلة للتطبيق واختبارها في مجموعة واسعة من الأنواع ومناسبة للتطبيقات المصب متعددة مثل الكربون 14 التي يرجع تاريخها 3، خلية-CYCLE تحليل 4، تصور من نظائرها ثيميدين (على سبيل المثال BrdU وإيدو) 4، وتحليل transcriptome وجينية.

يتم عزل نواة القلب عن طريق الترسيب وكثافة immunolabeled مع الأجسام المضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) لتحديد وفرز النوى cardiomyocyte بواسطة التدفق الخلوي.

العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

لقد شكل تحديد نوى الخلايا العضلية القلبية تحدياً في المقاطع النسيجية، حيث تعتمد معظم الاستراتيجيات فقط على البروتينات الواسمة السيتوبلازمية1. الأحداث النادرة ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل نوى الخلايا العضلية القلبية من أنسجة مأخوذة بعد الوفاة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجانس الأنسجة باستخدام مجانس مسباري وماسحة زجاجية، تليها عدة خطوات ترشيح. وتتمثل الخطوة الثانية في عزل الجزء النووي عن الأجزاء الخلوية الأخرى عن طريق طرد مركزي بالترسيب الكثافي.بعد ذلك، يتم وسم نوى الخلايا العضلية القلبية مناعياً باستخدام جسم مضاد مشتق ضد PCM1. وتتمثل الخطوة النهائية في عزل نوى الخلايا العضلية القلبية الموصومة عن طريق فرز الخلايا المنشط فلورياً. وفي النهاية، وقبل إجراء المزيد من المعالجات اللاحقة، يتم التأكد من نقاء نوى الخلايا العضلية القلبية من خلال إعادة تحليل أجزاء النوى التي تم فرزها.تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تحليل نوى الخلايا العضلية القلبية بكفاءة متساوية سواء من الأنسجة الطازجة أو الأنسجة المؤرشفة والمجمدة وبإنتاجية عالية. وتعتبر الدراسات القائمة على DNA في الخلايا العضلية القلبية صعبة للغاية لعدة أسباب؛ أولاً، لأن الخلايا العضلية القلبية تشكل حوالي 20 30% فقط من خلايا القلب.علاوة على ذلك، فهي تحتوي على أنوية بدرجة كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا العضلية القلبية تكون متعددة الصيغ الصبغية بدرجة كبيرة. وتتجاوز الطريقة الموصوفة هنا كل هذه العقبات.قبل البدء في الإجراء، قم بطلاء أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق بـ 10 milliliters من محلول طلاء مكون من 1%BSA بالإضافة إلى PBS. بعد تدوير الأنابيب لمدة 30 دقيقة، قم بإزالة محلول الطلاء واتركها لتجف في الهواء.ابدأ إجراء عزل النوى القلبية باستخدام المشرط لتشريح البطين الأيسر من قلب فأر مجمد تجميداً سريعاً. قم بتقطيع العينة المشرحة إلى قطع صغيرة، ثم انقل قطع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter مملوء بـ 15 milliliters من محلول التحلل (lysis buffer). بعد ذلك، قم بتجانس أنسجة القلب باستخدام مجانس مسباري بسرعة 24,000 RPM لمدة 10 ثوانٍ، ثم خفف التجانس بحجم مساوٍ من محلول التحلل ليصل الإجمالي إلى 30 milliliters. انقل التجانس إلى مجانس زجاجي (glass down homogenizer) باستخدام ثماني ضربات بمدقة ذات خلوص كبير لتحرير النوى.بعد ذلك، قم بتمرير النوى الخام. يتم العزل أولاً عبر مصفاة خلايا بمسامية 100 micron، ثم عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 micron في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter. الآن، قم بطرد عينة النوى الخام المعزولة مركزياً لمدة 10 دقائق عند 700 ×g ودرجة حرارة أربع درجات Celsius.اقلب الأنبوب لإزالة السائل الطافي بعناية، ثم امسح الجزء الداخلي من الأنبوب بمنشفة ورقية، مع الحرص على عدم تعريض كتلة النوى للاهتزاز. اسحب المحلول بالماصة للأعلى وللأسفل عدة مرات لإعادة تعليق النوى الخام.قم بالعزل في 5 milliliters من محلول السكروز المنظم، ثم أضف 25 milliliters إضافية من محلول السكروز المنظم إلى معلق النوى. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من محلول السكروز المنظم المُحضّر حديثاً إلى أحد أنابيب الطرد المركزي الفائق المغلفة والمحضرة مسبقاً. ثم قم بعناية بوضع محلول راسبة النوى المُعاد تعليقها فوق طبقة المحلول المنظم.بعد موازنة الأنبوب في دوّار حر الحركة، ضع الدوّار في جهاز طرد مركزي عالي السرعة وقم بتدوير عينة النوى لمدة 60 دقيقة عند 13,000 ×g ودرجة حرارة أربع درجات Celsius. عند اكتمال عملية التدوير، أخرج الأنابيب بعناية من الدوّار واقلبها مرة أخرى. للتخلص من السائل الطافي، امسح البقايا المتبقية من داخل الأنبوب باستخدام مناديل ورقية كما سبق، ثم أعِد تعليق ركازة النوى في واحد milliliter من محلول تخزين النوى.قبل البدء في إجراء الصبغ المناعي، انقل مقدار 20 µL من عينة النوى إلى أنبوب فكس. أضف 980 µL من محلول تخزين النوى إلى هذه العينة وقم بتسمية الأنبوب "الضابط السلبي". الآن، أضف الجسم المضاد anti PCM one إلى عينة النوى وأنابيب الضابط السلبي بتخفيف قدره 1:500.بعد ذلك، يتم تحضين كلا الأنبوبين عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، وبعد غسل الأنابيب باستخدام محلول تخزين النوى والتخلص من الطافي، يتم إعادة تعليق رواسب النوى في 1 mL آخر من محلول تخزين النوى.بعد ذلك، أضف جسماً مضاداً ثانوياً فلورياً مضاداً للأرانب إلى عينات الخلايا بتخفيف 1:100، وقم بحضنها عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. وبعد غسل الأنابيب باستخدام محلول حفظ النوى، أعد تعليق الراسب في 1 mL من محلول حفظ النوى لإجراء الفرز والتحليل بالتدفق الخلوي، وبعد طلاء أنابيب تجميع النوى باستخدام BSA وPBS كما في بداية الفيديو، ابدأ بترشيح العينة والضابط السلبي من خلال مصافي خلايا فردية بحجم 30 micron. وقبل التحميل مباشرة، أضف صبغة DNA.أضف تخفيفًا بنسبة 1 إلى 500 لتحديد تجمعات النوى. قم بتحميل العينة الضابطة السلبية على جهاز قياس التدفق الخلوي. استخدم معاملات التشتت الأمامي والجانبي لوضع البوابة الأولى لتحديد نوى القلب، بشكل مشابه لمخطط النقاط (DOT plot) الموضح هنا.بعد ذلك، استخدم معلمات التشتت الأمامي وعرض نبضة التشتت الأمامي لإنشاء بوابة ثانية حول النوى المنفردة، بشكل مشابه لمخطط DOT الموضح هنا. الآن، قم بتحميل العينة المحددة مناعيًا وضع البوابة الثالثة لتمييز نوى الخلايا العضلية القلبية الموجبة لـ PCM one عن نوى الخلايا غير العضلية القلبية السالبة لـ PCM one. استخدم صبغة الحمض النووي النووي لتحليل محتوى DNA وإجراء تحليل للدورة الخلوية بشكل مشابه للتحليل الموضح في هذا المدرج التكراري.بعد فرز النوى بناءً على إيجابية PCM one، توضع النوى المفرزة على الثلج، ويُعاد تحليل جزء من كل عينة مفرزة لتحديد درجة نقاء الفرز. وأخيرًا، تُرسّب النوى المفرزة في أنابيب التجميع عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة بسرعة 1500 ×g ودرجة حرارة 4 °C. وبعد التخلص من السوائل الطافية، تُعلق كتل النوى في محلول منظم متوافق مع التطبيق المطلوب لاحقًا.في هذا الشكل الأول، صُبغ قلب فأر بالغ بصبغة نووية وأجسام مضادة ضد PCM one، وعامل نسخ قلب الفأر NKX2.5، وسلسلة الميوسين الثقيلة أو MHC. يظهر هنا تكبير لصورة التراكب من الشكل السابق. لاحظ كيف أن النوى المحددة بـ PCM one باللون الأبيض تعبر عن عامل النسخ NKX2.5 باللون الأحمر، وهي محاطة بسيتوبلازم الخلايا العضلية القلبية باللون الأخضر.توضح هذه البيانات مجتمعة الدقة التي يحدد بها صبغ PCM one نوى الخلايا العضلية القلبية. يبرز المربع الداخلي نمط صبغ PCM one فوق النووي في نوى الخلايا العضلية، كما تشير الأسهم كذلك في التجربة الموضحة في الأشكال الثلاثة التالية، حيث صبغَت نوى القلب المعزولة بصبغة DNA المسماة DRAC five، وبأجسام مضادة ضد PCM one. وهنا، وفي تراكب الشكلين السابقين، تسلط الأسهم الضوء مرة أخرى على نمط صبغ PCM one فوق النووي في نوى الخلايا العضلية القلبية المعزولة.يوضح هذا المخطط النقطي أن ما يقرب من 30% من النوى المعزولة بهذه الطريقة هي نوى خلايا عضلية قلبية، كما يتضح من وسم PCM one الخاص بها. وأخيرًا، وكما توضح هذه الرسوم البيانية، فإن نوى الخلايا العضلية القلبية للفئران هي في الغالب ثنائية الصيغة الصبغية (diploid) كما يشير ذروة 2N، وهناك مجموعة فرعية صغيرة فقط رباعية الصيغة الصبغية (tetraploid) كما تشير ذروة 4N الأصغر. ومن مميزات هذه التقنية أنه يمكن تكييفها بسهولة لأنواع أخرى.أما بالنسبة للبشر.

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

المعرفة الحالية على أساس الخلوية من أمراض القلب تعتمد في الغالب على دراسات على نماذج حيوانية. نحن هنا وصف والتحقق من صحة طريقة جديدة للحصول العضلية قابلة للحياة واحد من عينات جراحية صغيرة من عضلة القلب البطيني الإنسان. myocytes البطين الإنسان يمكن أن تستخدم للدراسات الكهربية واختبار المخدرات.

عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

يعد القياس الكمي لدوران خلايا عضلة القلب أمرا صعبا. يقدم البروتوكول الموصوف هنا مساهمة مهمة في هذا التحدي من خلال تمكين القياس الكمي الدقيق والحساس لتوليد نوى خلايا عضلة القلب الجديدة وعدد النوى.

تقييم في وقت واحد Cardiomyocyte الحمض النووي تحضير والصيغة الصبغية: طريقة لمساعدة الكمي لCardiomyocyte التجديد ودوران

للتمييز بين انقسام الخلايا واختلافات دورة الخلية في خلايا عضلة القلب ، نقدم بروتوكولات باستخدام خطين من الفئران المعدلة وراثيا: الفئران المعدلة وراثيا Myh6-H2B-mCh ، للتحديد الواضح لنوى خلايا عضلة القلب ، وفئران CAG-eGFP-anillin ، لتمييز انقسام الخلايا عن اختلافات دورة الخلية.

تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

الهدف من هذا العمل هو تطوير طريقة لعزل عضلة القلب بشكل مستنسخ من القلب البالغ وقياس محتوى الحمض النووي والنية.

عزل القلب من القلب الثابتة للكيمياء المناعية وتحليل بلودي

قدم هو بروتوكول لعزل القلب البطيني البشري والحيواني من شرائح عضلة القلب قطع هزاز. يمكن الحصول على غلة عالية من الخلايا المتحملة للكالسيوم (تصل إلى 200 خلية/ملغ) من كميات صغيرة من الأنسجة (&lt;50 ملغ). البروتوكول ينطبق على عضلة القلب المعرضة لاقفوية البرد لمدة تصل إلى 36 ساعة.

عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز

طورنا طريقة simple لعزل خلايا قلب الفأر الفردية عالية الجودة عن طريق تقنية التشويش المسبق. هذه الطريقة خالية من Langendorff ومفيدة لعزل الخلايا العضلية البطينية والأبطية أو الخلايا الخلالية ، مثل الخلايا الليفية القلبية أو السلف.

طريقة ال perfusion أنتيغراد لعزل القلب من الفئران

المعيار الذهبي في أمراض القلب للتجارب الوظيفية الخلوية والجزيئية هي خلايا عضلة القلب. توضح هذه المقالة التكيفات مع تقنية غير Langendorff لعزل خلايا عضلة القلب في الفئران.

طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا عضلة القلب في الفئران باستمرار

هنا ، نصف بروتوكولا لعزل كمية كافية من الخلايا العضلية غير القلبية المفردة ذات الصلاحية العالية من قلب الفأر بعد احتشاء عضلة القلب (MI). يمكن استخدام هذا لتسلسل الخلية الواحدة اللاحق ، وتحليل قياس التدفق الخلوي ، وزراعة الخلايا الأولية.

إعداد تعليق خلية غير عضلة القلب لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من قلب الفأر البالغ بعد احتشاء عضلة القلب

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف تحضير نوى الخلية. بعد التشريح المجهري والتفكك الأنزيمي للأنسجة القلبية إلى خلايا مفردة ، تم تجميد الخلايا السلفية ، تليها عزل الخلايا النقية القابلة للحياة ، والتي تم استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تحليلات تسلسل عالية الإنتاجية.

عزل النوى من الخلايا السلفية القلبية للفأر من أجل التنميط فوق الجينوم والتعبير الجيني بدقة خلية واحدة

تمت معالجة عينات أنسجة استئصال الشريان التاجي لعزل النوى المفردة باستخدام بروتوكول تفكك محسن. تم التحقق من سلامة النوى المعزولة من خلال ثلاثة طرق تكميلية: التلوين بتقنية التريبان بتقنية الاستبعاد الأزرق لتقييم سلامة الغشاء، والميكروسكوب الكونفوكلي المعتمد على DAPI لتأكيد الشكل النووي، وقياس تدفق الخلايا لقياس العائد والنقاء النووي.

عزل النواة المفردة من أنسجة استئصال الشريان التاجي البطني الرحمي لمرضى ترقيع الشريان التاجي

تعلم عزل نوى خلايا القلب من الأنسجة بعد الوفاة باستخدام التجانس والطرد المركزي وفرز الخلايا المُنشَّطة بالفلورة. هذه الطريقة تضمن نقاءً عاليًا للنوى المعزولة لدراسة وظائف القلب.

العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

استكشف المزيد من الفيديوهات