الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة استجابات الكالسيوم المستحثة بالمنبهات، مكانياً وزمانياً في شرائح الدماغ، سواء في العصبونات المحددة بـ GFP أو باستخدام صبغة مؤشر كالسيوم فلورية غير خضراء. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استخراج دماغ فأر معدل وراثياً يعبر عن GFP في خلايا محددة، وتتمثل الخطوة الثانية في تحضير شرائح نسيجية باستخدام الميكروتوم.

بعد ذلك، يتم نقل محلول تحميل صبغة مؤشر الكالسيوم بواسطة الماصة إلى الشرائح لتمكين الخلايا الدماغية من امتصاص الصبغة. والخطوة النهائية هي إجراء تسجيل زمني للخلايا الفلورية باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy). وفي النهاية، يتم إظهار استجابات الكالسيوم في العصبونات المأشورة بـ GFP باستخدام تحليل تصوير الكالسيوم متعدد الألوان.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية للمجهر البؤري في قدرتنا على تصوير الكالسيوم في العصبونات التي تستخدم تقنية GFP الفلورية الخضراء باستخدام صبغة مؤشر كالسيوم فلورية مزاحة نحو الأحمر. إن الإزاحة الطيفية الكبيرة للصبغة الحمراء تسمح لنا بإجراء تحليل متعدد الألوان للفلورية الحمراء بالتزامن مع GFP الخضراء باستخدام أطوال موجية واحدة للإثارة. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما واجهنا مشكلة في مراقبة إشارات الكالسيوم في العصبونات التي لم يكن بإمكاننا تحديدها إلا باستخدام تقنية فلورية جينية، وهي البروتين الفلوري الأخضر.

سأقوم الآن بتوضيح عدة خطوات حاسمة في هذا الإجراء. ابدأ الإجراء بصب محلول الآجار المسخن في طبق بتري مربع بارتفاع 1 cm، وبعد التبريد والتصلب، يتم تقطيع هلام الآجار بتركيز 4% إلى مكعبات بحجم 1 cubic centimeter وتوضع في زجاجة للتخزين. بعد قطع رأس الفأر، قم بقص فروة الرأس باستخدام شفرة حلاقة ذات حافة واحدة في الاتجاه السهمي المركزي من العظم الجبهي إلى النتوء القذالي الخارجي.

بعد ذلك، يتم فتح فروة الرأس المقطوعة بشكل أكبر أولاً في الاتجاه الجانبي المنقاري، ثم في الاتجاه البطني. بعد ذلك، يتم إجراء قطعين جانبيين وقطع واحد منقاري.

باستخدام مقص زنبركي صغير، قم بفصل الجمجمة بعناية عند الثقبة العظمى. في هذه اللحظة، يجب أن تكون العظام القذالية وبين الجدارية والجدارية قد انفصلت. إذا كانت الأم الجافية لا تزال موجودة، فقم بإزالتها بعناية باستخدام ملقط لمنع إلحاق الضرر بالدماغ.

بعد ذلك، قم بإزالة العظم الحرشفة، والثقبة الغربالية الأمامية، والثقبة الجبهية. الآن يمكن إزالة الدماغ بسهولة باستخدام ملعقة مجهرية مقلوبة، ويمكن قطع الأعصاب القحفية. يجب أن يوضع الدماغ على جانبه البطني على سطح مقاوم للقطع، بحيث يكون السطح البطني للدماغ للأسفل.

استخدم شفرة حلاقة ذات حافة واحدة لإزالة المخيخ. سيمثل سطح القطع المستقيم هذا الأساس لتثبيت الدماغ على لوحة لتمكين تقطيع مقاطع دماغية إكليلية. بعد ذلك، قم بلصق الدماغ من جهة سطح القطع على اللوحة الأساسية للميكروتوم باستخدام كمية صغيرة من غراء السيانوأكريلات السريع التصلب وعالي الأداء.

بعد ذلك، يتم لصق كتلة من هلام الآجار بحجم سنتيمتر مكعب واحد عند الجانب البطني للدماغ على لوحة قاعدة الميكروتوم لدعم الدماغ وتثبيته أثناء التقطيع. وبعد جفاف الرابط، توضع اللوحة في حمام الميكروتوم الذي يحتوي على محلول خارج خلوي مؤكسج ومبرد عند درجة حرارة 6 °C. ثم يتم تقطيع الدماغ إلى شرائح بسمك 300 microns وبسرعة تقطيع منخفضة، وتُجمع شرائح الدماغ الإكليلية حتى يتم تقطيع الدماغ بالكامل.

قم الآن بتحضير محلول onic F1 27 بتركيز 20% في DMSO عن طريق إضافة محلول DMSO إلى مسحوق onic F1 27. بعد ذلك، قم بإذابته عن طريق تعريض المحلول مباشرة للموجات فوق الصوتية لمدة دقيقتين. بعد ذلك، أضف 5 µL من محلول onic F1 27 بتركيز 20% إلى أنبوب يحتوي على 50 µg من furred am النفاذ للخلايا.

امزج المحلول باستخدام ماصة. ثم أضف 45 µL من المحلول خارج الخلية إلى المزيج وقم برجّه باستخدام جهاز الـ vortex. باختصار، أضف 325 µL إضافية من المحلول خارج الخلية وعالِج الأنبوب بالموجات فوق الصوتية لمدة ثلاث دقائق أخرى.

بعد عملية السونيكيشن، أضف 1.156 milliliters من المحلول خارج الخلوي المؤكسج للحصول على محلول تحميل مؤشر الكالسيوم D النهائي. انقل شرائح الدماغ الإكليلية إلى طبق زراعة خلايا مكون من ستة آبار مملوء بالمحلول خارج الخلوي المؤكسج، وبمعدل يصل إلى ست شرائح لكل بئر. بعد ذلك، قم بشفط المحلول خارج الخلوي المؤكسج من الحجرات مع الحرص على عدم إتلاف شرائح الدماغ.

بعد ذلك، يتم سحب 750 microliters من محلول تحميل مؤشر الكالسيوم D ونقله مباشرة إلى كل بئر، بحيث تُغطى شرائح الدماغ بالمحلول الذي يحتوي على rore am. بعد ذلك، تُحضن الشرائح في حاضنة زراعة الخلايا التي تحتوي على الأكسجين وثاني أكسيد الكربون لمدة تتراوح من 45 إلى 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 °C.

في نهاية فترة التحضين، استبدل محلول تحميل مؤشر الكالسيوم DI بمحلول خارج خلوي جديد مُشبع بالأكسجين لمنع التحميل المفرط للخلايا. ولمراقبة التغيرات في الإشارة الفلورية الناتجة عن التحفيز، انقل إحدى شرائح الدماغ المحملة بصبغة fure red إلى غرفة التسجيل وثبتها في الموضع المطلوب. بعد تركيب الغرفة على جهاز المجهر الكونفوكال، قم بتروية الشريحة لمدة 10 دقائق باستخدام المحلول خارج الخلوي المُشبع بالأكسجين لإزالة أي فائض من صبغة مؤشر الكالسيوم خارج الخلوية.

بعد الخروج من غرفة التسجيل، يتم تجميع PERFUSE eight في زجاجة مفرغة من الهواء. ثم يتم فحص الشريحة عبر المجهر بتكبير منخفض. قم بتدوين اتجاه الشريحة وتحديد المنطقة المراد دراستها في الشريحة، وهي في حالتنا هذه منطقة الوطاء في الدماغ.

بعد ذلك، قم بالتحويل إلى تكبير عالٍ. حدد الخلية المطلوبة في الشريحة عن طريق جمع صور GFP والتحقق في الوقت ذاته من شدة الفلورة لإشارة URA الحمراء. اضبط قدرة الليزر على قيمة تسمح بقياس التغير في شدة فلورة URA الحمراء، وتمنع بهتان الفلورة للمُفلورين.

بعد ذلك، ابدأ في التقاط الصور بمعدلات تتراوح بين 0.5 إلى 2 هيرتز لجمع إشارات fure و GFP. يوضح هذا الشكل الصورة المجهرية البؤرية لـ GN, RHR Tau GFP neurons في شريحة دماغية إكليلية. هذه هي إشارة الفلورة الموحدة نسبيًا التي لوحظت بعد تحميل الشريحة الدماغية بـ fure am، وهذه هي الصورة المدمجة التي تظهر الخلايا العصبية المحملة بصبغة مؤشر الكالسيوم.

إليك أمثلة على استجابات الكالسيوم المستحثة بالتحفيز الجسدي من عصبونات فردية موسومة بـ GFP في مناطق مختلفة من الدماغ في منطقة الوطاء. ويمكن مقارنة إشارات الكالسيوم المتميزة بين العصبونات التي تعبر عن GN RHR في نوى الوطاء المختلفة باستخدام المساحة تحت المنحنى كتقدير للتغير الكلي في الكالسيوم في خلية معينة خلال الفترة الزمنية ذاتها بمجرد إتقان العملية. ويمكن تنفيذ هذه التقنية في أقل من 90 دقيقة، بما في ذلك تحضير صبغة مؤشر الكالسيوم وتحميل الشرائح وحضنها إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.