الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة استجابات الكالسيوم المستحثة بالتحفيز ، سواء في الخلايا العصبية الموسومة ب GFP ، مكانيا وزمانيا في شرائح الدماغ باستخدام صبغة مؤشر الكالسيوم الفلورية غير الخضراء. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخراج دماغ الفأر المعدل وراثيا أولا الذي يعبر عن GFP في خلايا معينة. الخطوة الثانية هي تحضير شرائح الأنسجة باستخدام ميكروتوم.

بعد ذلك ، يتم سحب محلول تحميل صبغة مؤشر الكالسيوم على الشرائح لتمكين خلايا الدماغ من امتصاص الصبغة. الخطوة الأخيرة هي إجراء تسجيل الطابع الزمني لخلايا الفلورسنت باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. في النهاية ، تظهر استجابات الكالسيوم في الخلايا العصبية الموسومة ب GFP باستخدام تحليل تصوير الكالسيوم متعدد الألوان.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية للفحص المجهري متحد البؤر هي أنه يمكننا تصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية التقنية GFP الفلورية الخضراء باستخدام مؤشر الكالسيوم الفلوري المحمر. يسمح لنا التحول الهائل للشوط المنخفض باللون الأحمر بإجراء تحليل متعدد الألوان للتألق الأحمر مع GFP الأخضر باستخدام أطوال موجية إثارة واحدة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما واجهنا مشكلة مراقبة إشارات الكالسيوم في الخلايا العصبية التي لم نتمكن من تحديدها إلا باستخدام تقنية الفلورسنت الوراثية ، والتي كانت بروتين التألق الأخضر.

سأوضح الآن العديد من الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء. ابدأ الإجراء بصب محلول أجار الساخن في طبق بتري مربع على ارتفاع سنتيمتر واحد بعد التبريد والتصلب ، يتم تقطيع هلام أجار بنسبة 4٪ إلى كتل من سنتيمتر مكعب واحد ووضعها في زجاجة للتخزين. بعد قطع رأس الفأر ، قم بقص فروة الرأس بشفرة حلاقة ذات حافة واحدة في الاتجاه السهمي المركزي من العظم الأمامي إلى النتوء القذالي الخارجي.

بعد ذلك ، افتح فروة الرأس المقطوعة أولا في الاتجاه الجانبي المنقاري. ثم في الاتجاه البطني. ثم قم بعمل قطعتين جانبيتين وواحدة منقارية.

في الثقبة ماغنوم بمقص زنبركي صغير ، قم بشق الجمجمة بعناية. في هذه اللحظة ، يجب فصل العظام القذالية بين الجدارية والجداري. إذا كانت مادة الجافية لا تزال موجودة ، فقم بإزالتها بعناية باستخدام زوج من الملقط لمنع تلف الدماغ.

بعد ذلك ، قم بإزالة العظم الحرشفية والثقب الغربالي الأمامي والثقب الأمامي. الآن يمكن إزالة الدماغ بسهولة باستخدام ملعقة صغيرة مقلوبة ويمكن قطع الأعصاب القحفية. يجب أن يهبط الدماغ على جانبه البطني على سطح مقاوم للقطع مع السطح البطني للدماغ لأسفل.

استخدم شفرة حلاقة ذات حافة واحدة لإزالة المخيخ. سيكون هذا السطح المقطوع المستقيم هو الأساس لتركيب الدماغ على صفيحة لتمكين تقطيع أقسام الدماغ الإكليلية. بعد ذلك ، قم بلصق الدماغ بالسطح المقطوع على اللوحة الأساسية للميكروتوم باستخدام كمية صغيرة من الغراء الفائق اللاصق عالي

بعد ذلك ، قم بلصق كتلة هلام أجار بحجم سنتيمتر مكعب واحد في الجانب البطني من الدماغ على اللوحة الأساسية للميكروتوم لدعم الدماغ وإصلاحه أثناء التقطيع. بعد أن تجف الرابطة ، ضع اللوحة في حمام الميكروتوم الذي يحتوي على ست درجات مئوية من محلول خارج الخلية الأكسجين البارد. ثم قم بتقطيع الدماغ إلى شرائح بسمك 300 ميكرون بسرعة تقطيع منخفضة ، ويتم جمع شرائح الدماغ الإكليلية حتى يتم تقسيم الدماغ بالكامل.

الآن قم بإعداد 20٪ Onic F1 27 في محلول DMSO عن طريق إضافة محلول DMSO إلى مسحوق Onic F1 27. بعد ذلك ، قم بحله عن طريق صوتي المحلول مباشرة لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من محلول F1 27 20٪ إلى أنبوب من 50 ميكروغراما من الفراء النفاذية للخلية.

امزج المحلول مع ماصة. ثم أضف 45 ميكرولترا من المحلول خارج الخلية إلى الخليط وقم بدوامه. باختصار ، أضف 325 ميكرولتر إضافيا من المحلول خارج الخلية وقم بصوتنة الأنبوب لمدة ثلاث دقائق أخرى.

بعد الصوتنة ، أضف 1.156 مل من محلول خارج الخلية المؤكسج للحصول على محلول تحميل مؤشر الكالسيوم D النهائي. انقل شرائح الدماغ الإكليلي إلى صفيحة ثقافة من ستة خلايا آبار مملوءة بمحلول خارج الخلية المؤكسج حتى ست شرائح لكل بئر. ثم استنشق المحلول المؤكسج خارج الخلية من الغرف مع الحرص على عدم إتلاف شرائح الدماغ.

بعد ذلك ، قم بتحميل 750 ميكرولتر من محلول تحميل مؤشر الكالسيوم D مباشرة إلى كل منها. حسنا ، يجب تغطية شرائح الدماغ بالمحلول الذي يحتوي على rore am. بعد ذلك ، قم باحتضان الشرائح في حاضنة زراعة خلايا ثاني أكسيد الكربون بالأكسجين لمدة 45 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة ، استبدل محلول تحميل مؤشر الكالسيوم DI بمحلول جديد مؤكسج خارج الخلية لمنع التحميل الزائد على الخلايا. لمراقبة التغيرات الناجمة عن التحفيز في إشارة الفلورسنت ، انقل إحدى شرائح الدماغ المحملة باللون الأحمر إلى غرفة التسجيل وضعها حسب الرغبة. بعد تركيب الغرفة على إعداد المجهر متحد البؤر ، قم ببث الشريحة لمدة 10 دقائق بمحلول مؤكسج خارج الخلية لإزالة أي فائض من صبغة مؤشر الكالسيوم خارج الخلية.

بعد الخروج من غرفة التسجيل ، يتم جمع PERFUSE ثمانية في زجاجة مفرغة. ثم انظر إلى الشريحة من خلال المجهر بتكبير منخفض. قم بتدوين اتجاه الشريحة وابحث عن منطقة الاهتمام في الشريحة في حالتنا منطقة ما تحت المهاد في الدماغ.

بعد ذلك ، قم بالتغيير إلى التكبير العالي. ابحث عن الخلية ذات الأهمية في الشريحة عن طريق جمع صور GFP والتحقق في نفس الوقت من شدة التألق لإشارة URA الحمراء. اضبط طاقة الليزر على قيمة تسمح بإجراء قياسات في تغيير شدة التألق الأحمر URA ، وتمنع تبييض الفلوروفورين.

بعد ذلك ، ابدأ في الحصول على صور بمعدلات تتراوح بين 0.5 إلى اثنين هرتز لجمع إشارات fure و GFP. يوضح هذا الشكل الصورة متحدة البؤر للخلايا العصبية GN و RHR Tau GFP في شريحة دماغية إكليلية. هذه هي الإشارة الفلورية المنتظمة نسبيا التي لوحظت بعد تحميل شريحة الدماغ ب fure am وهذه هي الصورة المدمجة التي تظهر الخلايا العصبية المحملة بصبغة مؤشر الكالسيوم.

فيما يلي أمثلة على استجابات الكالسيوم المستحثة بالتحفيز الجسدي من الخلايا العصبية الفردية الموسومة ب GFP في مناطق مختلفة من الدماغ تحت المهاد. يمكن مقارنة إشارات الكالسيوم المميزة بين GN RR التي تعبر عن الخلايا العصبية لنوى ما تحت المهاد المختلفة باستخدام المنطقة الواقعة أسفل المنحنى كتقدير للتغير الكلي في الكالسيوم في خلية معينة خلال نفس الفترة بمجرد إتقانها. يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من 90 دقيقة ، بما في ذلك تحضير صبغة مؤشر الكالسيوم ، وتحميل وحضانة الشرائح إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.