الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة استجابات الكالسيوم المستحثة بالمنبهات، مكانياً وزمانياً، في العصبونات الموسومة بـ GFP وفي شرائح الدماغ باستخدام صبغة مؤشر كالسيوم فلورية غير خضراء. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق استخراج دماغ فأر معدل وراثياً يعبر عن GFP في خلايا محددة. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضير شرائح نسيجية باستخدام الميكروتوم.

بعد ذلك، يتم سحب محلول تحميل صبغة مؤشر الكالسيوم بواسطة الماصة ووضعه على الشرائح لتمكين الخلايا الدماغية من امتصاص الصبغة. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء تسجيل زمني للخلايا الفلورية باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy). وفي النهاية، يتم عرض استجابات الكالسيوم في العصبونات الموسومة بـ GFP باستخدام تحليل تصوير الكالسيوم متعدد الألوان.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية للمجهر البؤري (confocal microscopy) في قدرتنا على تصوير الكالسيوم في عصبونات GFP الفلورية الخضراء باستخدام صبغة مؤشر كالسيوم فلورية ذات إزاحة حمراء. وتسمح لنا إزاحة ستوكس الكبيرة للفلور الأحمر بإجراء تحليل متعدد الألوان للفلورة الحمراء بالاشتراك مع GFP الخضراء باستخدام طول موجي واحد للإثارة. لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما واجهنا مشكلة في مراقبة إشارات الكالسيوم في عصبونات لم نتمكن من تحديدها إلا باستخدام تقنية فلورية جينية، وهي البروتين الفلوري الأخضر.

سأقوم الآن بتوضيح عدة خطوات حرجة من هذا الإجراء. ابدأ الإجراء بسكب محلول الآجار المسخن في طبق بتري مربع حتى يصل الارتفاع إلى 1 cm؛ وبعد تبريد وتصلب هلام الآجار بتركيز 4%، يتم تقطيعه إلى مكعبات بحجم 1 cubic centimeter وتوضع في زجاجة للتخزين. بعد قطع رأس الفأر، يتم قص فروة الرأس باستخدام شفرة حلاقة ذات حافة واحدة في الاتجاه السهمي المركزي من العظم الجبهي إلى النتوء القذالي الخارجي.

بعد ذلك، قم بتوسيع فتحة فروة الرأس أولاً في الاتجاه الأنفي الجانبي، ثم في الاتجاه البطني. بعد ذلك، قم بإجراء شقين جانبيين وشق أنفي واحد.

استخدم مقصاً نابضاً صغيراً لفصل الجمجمة بعناية عند الثقبة العظمى. في هذه المرحلة، يجب أن تكون العظام القذالية والبينية الجدارية والجدارية قد انفصلت. إذا كانت الأم الجافية لا تزال موجودة، فقم بإزالتها بعناية باستخدام ملقط لمنع إتلاف الدماغ.

بعد ذلك، قم بإزالة العظم القشري، والثقبة الغربالية الأمامية، والثقبة الجبهية. الآن يمكن إزالة الدماغ بسهولة باستخدام ملعقة مجهرية مقلوبة، كما يمكن قطع الأعصاب القحفية. يجب أن يستقر الدماغ على جانبه البطني على سطح مقاوم للقطع بحيث يكون السطح البطني للدماغ للأسفل.

استخدم شفرة حلاقة ذات حافة واحدة لإزالة المخيخ. وسيشكل سطح القطع المستوي هذا الأساس لتثبيت الدماغ على لوحة لتمكين تقطيع مقاطع إكليلية من الدماغ. بعد ذلك، قم بلصق الدماغ من جهة سطح القطع على اللوحة القاعدية للميكروتوم باستخدام كمية صغيرة من غراء السيانوأكريلات فائق القوة عالي الأداء وسريع التصلب.

بعد ذلك، يتم لصق كتلة من هلام الآجار بحجم سنتيمتر مكعب واحد عند الجانب البطني للدماغ على القاعدة الأساسية للميكروتوم لدعم الدماغ وتثبيته أثناء التقطيع. وبعد جفاف الرابط، توضع القاعدة في حمام الميكروتوم الذي يحتوي على محلول خارج خلوي مؤكسج مبرد عند درجة حرارة 6 °C. ثم يتم تقطيع الدماغ إلى شرائح بسمك 300 microns وبسرعة تقطيع منخفضة، وتُجمع شرائح الدماغ الإكليلية حتى يتم تقطيع الدماغ بالكامل.

قم الآن بتحضير محلول onic F1 27 بنسبة 20% في DMSO عن طريق إضافة محلول DMSO إلى مسحوق onic F1 27. بعد ذلك، قم بإذابته عن طريق تعريض المحلول للموجات فوق الصوتية مباشرة لمدة دقيقتين. بعد ذلك، أضف 5 µL من محلول onic F1 27 بنسبة 20% إلى أنبوب يحتوي على 50 µg من furred am النفاذ للخلايا.

اخلط المحلول باستخدام ماصة. ثم أضف 45 µL من المحلول خارج الخلوي إلى الخليط وقم بمزجه بجهاز vortext. وبإيجاز، أضف 325 µL إضافية من المحلول خارج الخلوي وعالج الأنبوب بالموجات فوق الصوتية لمدة ثلاث دقائق أخرى.

بعد عملية السونكة، أضف 1.156 milliliters من المحلول خارج الخلوي المؤكسج للحصول على محلول تحميل مؤشر الكالسيوم D النهائي. انقل شرائح الدماغ الإكليلية إلى طبق زراعة خلايا مكون من ستة آبار مملوء بالمحلول خارج الخلوي المؤكسج، بمعدل يصل إلى ست شرائح لكل بئر. بعد ذلك، اسحب المحلول خارج الخلوي المؤكسج من الحجرات مع الحرص على عدم إتلاف شرائح الدماغ.

بعد ذلك، قم بنقل 750 µL من محلول تحميل مؤشر الكالسيوم D مباشرة إلى كل بئر، بحيث تكون شرائح الدماغ مغطاة بالمحلول الذي يحتوي على rore am. بعد ذلك، قم بتحضين الشرائح في حاضنة زراعة الخلايا التي تحتوي على الأكسجين وثاني أكسيد الكربون لمدة تتراوح من 45 إلى 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 °C.

في نهاية فترة الحضن، استبدل محلول تحميل مؤشر الكالسيوم DI بمحلول خارج خلوي طازج ومؤكسج لمنع التحميل المفرط للخلايا. ولمراقبة التغيرات في الإشارة الفلورية الناتجة عن التحفيز، انقل إحدى شرائح الدماغ المحملة بصبغة fure red إلى غرفة التسجيل وضعها في الموضع المطلوب. بعد تثبيت الغرفة على إعداد المجهر البؤري (confocal microscope)، قم بتروية الشريحة لمدة 10 دقائق بمحلول خارج خلوي مؤكسج لإزالة أي فائض من صبغة مؤشر الكالسيوم خارج الخلوية.

بعد الخروج من غرفة التسجيل، يتم جمع PERFUSE eight في زجاجة مفرغة من الهواء. بعد ذلك، يتم فحص الشريحة عبر المجهر بتكبير منخفض. قم بتدوين اتجاه الشريحة وتحديد المنطقة ذات الأهمية في الشريحة، والتي تكون في حالتنا هذه منطقة تحت المهاد في الدماغ.

بعد ذلك، انتقل إلى التكبير العالي. حدد الخلية المستهدفة في الشريحة عن طريق جمع صور GFP والتحقق في الوقت ذاته من شدة الفلورة لإشارة URA الحمراء. اضبط قدرة الليزر إلى قيمة تسمح بقياس التغير في شدة فلورة URA الحمراء، وتمنع تلاشي اللون (bleaching) لكلا الفلوروفورين.

بعد ذلك، ابدأ في الحصول على الصور بمعدلات تتراوح بين 0.5 إلى 2 hertz لجمع إشارات fure وGFP. يوضح هذا الشكل الصورة المجهرية البؤرية لـ GN وRHR Tau GFP neurons في شريحة دماغية إكليلية. هذه هي إشارة الفلورة المنتظمة نسبياً التي لوحظت بعد تحميل الشريحة الدماغية بـ fure am، وهذه هي الصورة المدمجة التي توضح العصبونات المحملة بصبغة مؤشر الكالسيوم.

فيما يلي أمثلة على استجابات الكالسيوم المستحثة بالمنبه الجسدي من عصبونات فردية موسومة ببروتين GFP في مناطق مختلفة من الدماغ تحت المهاد. ويمكن مقارنة إشارات الكالسيوم المتميزة بين العصبونات التي تعبر عن GN RHR في نوى مختلفة من تحت المهاد باستخدام المساحة تحت المنحنى كتقدير للتغير الكلي في الكالسيوم في خلية معينة خلال نفس الفترة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في أقل من 90 دقيقة، بما في ذلك تحضير صبغة مؤشر الكالسيوم، وتحميل الشرائح وحضنها، إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح.