Name: تحليل خلية معينة من ل arabidopsis يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: تعلم عزل البروتوبلاستات من أوراق Arabidopsis باستخدام الفرز الخلوي المنشط بالفلورسنت لدراسة التعبير الجيني في أنواع خلايا محددة. تتيح هذه التقنية تحليل البروتوميات والتشخيص الأيضي بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويدعم عمل في المختبر، ولاستون بوكانان على التنميط المرحلة خلية من نوع والتنموية المحددة من قبل المشروع أغرون-OMICS (منحة # LSHG-CT-2006-037704) في إطار أولى برنامج ال 6 من المفوضية الأوروبية. ويدعم عمل في المختبر على خلايا جيفورد من نوع التنميط محددة من منحة BBSRC محقق جديد (BB/H019502/1). تم الحصول على خطوط KC274 KC464 ول arabidopsis من AAR ويب (جامعة كامبردج).

1. البروتوبلازم الجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الأوراق والمواد مقطعة إلى شرائح 1 مم واسعة (الشكل 1) مع شفرة حلاقة. يمكن للأن العينات التي تحتوي على أكثر من ورقة واحدة تصل إلى 15 ورقة مكدسة بسهولة قبل القطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور الشرائط ورقة في طبق بتري الجولة 9 سم تحتوي على 20 مل محلول A (400 ملي مانيتول، 20 هيدرات MES ملي، 20 ملي بوكل، 10 ملي CaCl 2، 2 ملم MgCl 2، 0.1٪ و 2.5 ملي BSA β-المركابتويثانول، درجة الحموضة 5.7) بما في ذلك الإنزيمات protoplasting (1.2٪ السليلوز R-10، 0.6٪ و 0.4 RS السليلوز٪ macerozyme R-10) ومثبطات ريبونوكلياز والنسخي (1 × ProtectRNA و 10 ميكروغرام / مل الاكيتنوميسين D)؛ فصل بلطف ورقة وشرائط فراغ التسلل ل2 × 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مكان طبق بتري على شاكر المداري إلى 90 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة والبروتوبلازم للساعة 3-4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن الحضانة خلال فصل شرائط ورقة عن بعضها البعض، عن طريق استخداممجموعة من ملاقط شقة، في نصف ساعة فترات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلية ميكرون 70 مصفاة (فيشر العلمية) في أنبوب 50 مل وتصنف بلطف الحل من خلال protoplasting. سيؤدي هذا إلى إزالة الشرائط ورقة، والتي سيتم الاحتفاظ بها من منخل بينما يسمح للprotoplasts من خلال الذهاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائط ورقة مع حل مل 4 A وفلتر من خلال غربال بلطف نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل protoplasts في أنابيب أسفل الجولة وأجهزة الطرد المركزي الحل البروتوبلازم في 300 x ج لمدة 5 دقائق لprotoplasts بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بلطف أكبر قدر من طاف ممكن من دون إزعاج protoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل protoplasts مع الحل 5 مل A وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق على protoplasts في حجم مناسب لإيجاد حل، وذلك باستخدام ماصة باستور أو تلميح P1000 قطع. </li></ol> 2. FACS من Protoplasts ليف </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة قبل الفرز، وإعادة تعليق protoplasts باستخدام (غير قطع) P1000 تلميح لتجنب تراكمها protoplasts معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب protoplasts الفرز من خلال مرشح ميكرومتر filcon 50 (BD العلوم البيولوجية) وتمييع حسب الاقتضاء لتجنب انسداد فوهة من فارز الخلية. يتم فرز protoplasts باستخدام فوهة ميكرومتر 100 في ضغط من 20 رطل لكل بوصة مربعة (غمد) و21-21،5 PSI (العينة)، تردد قدرها 39.2 كيلو هرتز ومعدل حالة &lt;4000 (هذه الإعدادات هي الأمثل على خلية تدفق BD فارز قد دينار بحريني (العلوم البيولوجية). الأمثل على غيرها من آلات الفرز الخلية تحتاج تعديلات على هذه الإعدادات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد protoplasts GFP إيجابية باستخدام الليزر 488 نانومتر الأرجون والتآمر على الإخراج من ممر الموجة مرشح 580/30 (البرتقال) مقابل تصفية 530/40 ممر الموجة (الخضراء). سوف تكون إيجابية protoplasts GFP في السكانية العالية 580 530/low، مع المنظمات غير GFP protoplasts في عدد السكان منخفضة 580 530 / منخفضة والأموات / protoplasts الموت والحطام في الشعبية التي عالية 580lation (الشكل 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يكون الترتيب protoplasts التي سيتم استخراج الحمض النووي الريبي، ينبغي فرزها protoplasts مباشرة إلى ما لا يقل عن 4 مجلدات للتحلل تحتوي على مخزن مؤقت عامل مختزل (مثل β-المركابتويثانول). وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يقتصر ذلك الوقت نوعا من عينة واحدة ل20-30 دقيقة، وبحد أقصى من سنتين إلى ثلاث عينات معالجتها في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرؤية protoplasts مصنفة، ينبغي فرز protoplasts مباشرة إلى ما لا يقل عن 8 مجلدات عن حل وجمعها في وقت لاحق عن طريق الطرد المركزي لتركيز protoplasts. </li></ol></li></ol> 3. ممثل النتائج يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على protoplasts من أوراق arabidopsis، والتي تستخدم لتنشيط الخلايا الفرز مضان (الشكل 1). الجيل البروتوبلازم في وجود مثبطات ريبونوكلياز والنسخي يمنع الخلايا وROM تصاعد استجابة النسخي. هذا لا يكون نتيجة لمما أدى إلى العديد من القتلى وprotoplasts الموت، التي لديها قدر كبير من تألق ذاتي. عندما يكون الترتيب على استعداد protoplasts مع هذا الأسلوب هو بالتالي الشائع جدا أن نرى العديد من السكان متميزة في الرسوم البيانية من 580 نانومتر مقابل 530 نانومتر مضان المستخدمة في الفرز. وترد أمثلة على هذا، جنبا إلى جنب مع بوابات الفرز المستخدمة في هذا البروتوكول في الشكل 3. يمكن فرز Protoplasts إلى 8 مجلدات من حل وجمعها لتصور للتحقق من تخصيب اليورانيوم. 2G يوضح الشكل مثالا على ذلك باستخدام خط TP382، الذي يعبر عن GFP في خلايا الحرس. وترد أمثلة على العوائد التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة، قبل وبعد التضخيم، في الجدول 1. المبالغ التي تم الحصول عليها كافية لتضخيم باستخدام نظام WTA الحفاوة بيكو (500 خريج-50 نانوغرام)، وبالتالي ليالي<html> ubsequent التحليل من قبل أي من qPCR (الشكل 4)، بجانب جيل أو التسلسل ميكروأري. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" /> الشكل 1. سير العمل الإجمالي للتجربة. 1) حصاد أوراق الفائدة من GFP التعبير عن خط ل arabidopsis. 2) بسرعة إلى قطع شرائح 1 ~ واسعة ونقل على الفور مم في حل هذه protoplasting والفراغ التسلل. 3) احتضان لمدة ساعة 3-4. 4) حل بلطف البروتوبلازم الترشيح من خلال غربال ميكرومتر 70، نقل لجولة أنابيب أسفل وprotoplasts بيليه بواسطة الطرد المركزي. 5) مباشرة قبل الفرز، protoplasts إعادة تعليق ونقل إلى أنبوب الفرز من خلال ميكرومتر 50 مرشح. 6) ترتيب GFP إيجابية وسلبية protoplasts GFP قابلة للحياة. يمكن 7) الآن Protoplasts يتم تحليلها إما بصريا أو باستخدام تقنيات مثل qPCR، بجانب جيل أو التسلسل ميكروأري. together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig2.jpg" /> الشكل 2. خطوط KC464، KC274 وTP382 المستخدمة في هذه الدراسة. A) قسم عرضية من ورقة تظهر التعبير GFP KC464 في البشرة متجه نحو المحور. B) Protoplasts المستمدة من KC464 الأوراق. C) قسم عرضية من ورقة تظهر التعبير GFP KC274 في الأوعية الدموية. D) Protoplasts المستمدة من KC274 الأوراق. E) ورقة تبين TP382 التعبير GFP في خلايا الحرس. F) Protoplasts المستمدة من TP382 الأوراق. G) مثال للتخصيب التي حصلت عليها من FACS GFP التعبير عن خلايا الحرس في الخلفية المعقدة من الخلايا ورقة، والتي تبين GFP تحتوي على protoplasts من 580 530/low السكانية العالية من protoplasts المستمدة من TP382 الأوراق. AF: صور المجهر متحد البؤر، G: الإسفار صورة المجهر. على نطاق والحانات داخل الصور هي 50 ميكرومتر. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" /><html> الشكل 3. نموذجي نقطة اقتناء قطع FACS الإخراج من نانومتر 580/30 (البرتقالي) في مقابل 530/40 نانومتر (الأخضر) مرشحات ممر الموجة (BD فارز الخلية تدفق). أبواب الفرز أظهرت هي تلك التي تستخدم عادة أثناء الفرز. A) نقطة قطعة protoplasts العقيد-4 أوراق المشتقة، protoplasted في غياب مثبطات، مما يدل على انخفاض واحد 530/low 580 السكان. B) نقطة مؤامرة من protoplasts العقيد WT-4 أوراق المشتقة، protoplasted في وجود مثبطات، مما يدل على تحول في مضان 580 بسبب الإجهاد والتلوين من مثبطات. CE) نقطة المؤامرات من أوراق protoplasts المستمدة من خطوط KC74، وKC464 TP382، على التوالي، protoplasted في وجود مثبطات، والتي تبين GFP تحتوي على السكان في 530/low عالية 580 السكان. وبالنظر إلى النسب المئوية للأحداث في السكان (الأعلى 530/low 580) GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . e_content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" /> الشكل 4. GFP التعبير في الكسور السكان بوابات ممثل كما هو موضح في الشكل 3. تم الحصول على اثنين البيولوجية مكررات لكل نوع الكسر، تضخيم باستخدام الحفاوة بيكو WTA النظام وqPCR باستخدام GFP محددة الاشعال (الجدول 2) تم تنفيذ ذلك الحين. القيم المعروضة هي أعلى (الأحمر)، والقيم النسبية أقل (الخضراء) والمتوسط. وكان عدد السكان 580 عالية في هذه الحالة تقسيم في اثنين، وانخفاض 530/low 580 و 530/low عالية 580، والتي كانت تستخدم لتكرار واحد البيولوجية حتى يظهر فقط قيمة واحدة. وقد استخدم ACT2 (At3g18780) كمعيار لجميع العينات. ورقة: ورقة الجامعة. لم يتم فرزها: protoplasts لم يتم فرزها. GFP1: 530/low عالية 580 و Rest1: 530/low منخفضة 580، GFP2: 530/high عالية 580 و Rest2: 530/high منخفضة 580، كما هو موضح في الشكل (3) وأدخل. النتائج هي يا التحققو التقييمات البصرية من محتوى الخلية GFP في الكسور مصنفة (2G الشكل على سبيل المثال). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة </td><td> عدد الأوراق </td><td> عدد الخلايا </td><td> الحمض النووي الريبي العائد (NG) </td><td> الحمض النووي الريبي العائد (تضخيم؛ نانوغرام) </td></tr><tr><td> كلها رقة A كلها أوراق B </td><td> 1 1 </td><td> - - </td><td> 8001 10525 </td><td> 4623 *** 4572 *** </td></tr><tr><td> لم يتم فرزها protoplasts A لم يتم فرزها protoplasts B </td><td> 5 5 </td><td> - - </td><td> 2433 2625 </td><td> 1152 *** 3321 *** </td></tr><tr><td> GFP1 A Rest1 A </td><td> 15 </td><td> 6039 (0.39٪ *) 55389 (6.4* 0٪) </td><td> - ** - ** </td><td> 861 489 </td></tr><tr><td> GFP1 B Rest1 B </td><td> 15 </td><td> 10783 (0.63٪ *) 57040 (7.49٪ *) </td><td> - ** - ** </td><td> 537 420 </td></tr><tr><td> GFP2 Rest2 </td><td> 15 </td><td> 18337 (1.49٪ *) 62405 (73.49٪ *) </td><td> - ** - ** </td><td> 360 411 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. عينات التي تم جمعها وتحليلها باستخدام FACS مع qPCR لتحديد أي جزء الواردة الحية، معربا عن GFP protoplasts. وشملت أيضا في هذا الجدول هو العائد الحمض النووي الريبي مجموع نانوغرام في قبل وبعد التضخيم مع نظام بيكو WTA الحفاوة (NuGen). وكما هو مبين GFP1، GFP2، وRest1 Rest2 كسور في إدراج في الشكل 4. * تعطى النسبة المئوية للخلايا على المدى الخلية فرز بين قوسين بجانب إجمالي عدد الخلايا في الكسر. لا ترتبط هذه النسب إلىتم إيقاف بعضهم البعض لكل عينة وهذا النوع FACS يمتد لكسور &#39;الراحة&#39; في وقت سابق من لكسور GFP نظرا لعدد أكبر بكثير من الخلايا الراحة التي تم جمعها. ** 50 نانوغرام تستخدم كمدخل لتفاعلات التضخيم، وفقا بروتوكول الشركة المصنعة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كتاب تمهيدي </td><td> تسلسل </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.fw </td><td> GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.rv </td><td> TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT </td></tr><tr><td> ACT2.fw </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr><tr><td> ACT2.rv </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr></tbody></table> الجدول 2. الاشعال qPCR.

<ol><li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves%3A+A+Critical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li>
<li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gene+Expression+Map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gene Expression Map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Tissue-+and+Organ-specific+Phytochrome+Responses+using+FACS-assisted+Cell-type+Specific+Expression+Profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. (39), e1925(2010).</li>
<li>Beal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+For+Gene+Expression+and+Chromatin+Profiling+of+Individual+Cell+Types+Within+a+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue.</a> Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li>
<li>Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> PNAS. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Root+Expression+Patterns+Revealed+in+a+High-Resolution+Spatiotemporal+Expression+Map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> PNAS. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+identity+mediates+the+response+of+Arabidopsis+roots+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.</a> Science. 320, 942-945 (2008).</li>
<li>Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
<li>Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li>
<li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li>
<li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it%27s+potential+as+a+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6(2008).</li>
<li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد وصفت لنا طريقة التي تسمح للاستخدام النباتات معربا عن GFP ل arabidopsis في الأوراق لتوليد البروتوبلازم واللاحقة الفرز الخلية باستخدام FACS. هذه الطريقة تعطي كميات كافية من الحمض النووي الريبي لاستخدامها لتضخيم والتحليل اللاحق لذلك من قبل أي من qPCR أو ميكروأري. والتخصيب في الكسور لفرز الخلايا التي تحتوي على GFP، كما يتبين من qPCR (الشكل 2). لتحقيق عوائد عالية من protoplasts الحية من الأهمية بمكان العمل بسرعة خلال الخطوات الأولية لهذا الإجراء، حتى شرائط ورقة تم الفراغ تسلل مع الحل البروتوبلازم التي تحتوي على مثبط. وبالإضافة إلى ذلك، عند إنشاء شرائح 1 مم ورقة من المهم جدا لشريحة أو قطع الأوراق بدلا من &#39;فرم&#39; أو الهريس لهم، وهذا يؤدي إلى الضرر المفرط وبالتالي تحقيق عائد أقل البروتوبلازم. ووصف الفرق الحاسم بين طريقة أخرى هنا والمنشورهد طرق هو استخدام مثبطات مثبطات ريبونوكلياز والنسخي. يتم تطوير معظم الطرق لجذور arabidopsis، والتي يمكن أن تتولد protoplasts بسهولة أكبر. ومع ذلك، عند العمل مع أوراق، باستثناء نسيج الورقة المتوسط، من الضروري زيادة الوقت الجيل البروتوبلازم. ولذلك من المهم أن تشمل هذه مثبطات للحماية من التغيرات في التعبير الجيني نتيجة للمعاملة نفسها الجيل البروتوبلازم (المعطيات غير معروضة). ومع ذلك، فإن وجود مثبطات يؤدي إلى عدم القدرة على إيجاد رد فعل النسخ، إما عن طريق التحول الجينات أو إيقاف تشغيلها، والتي من المرجح أن تجعل protoplasts أكثر عرضة لأن هذا يؤدي إلى فقدان اللدونة التي لمواجهة الضغوط من protoplasting الداخلي. وقد استخدمنا الطريقة الموضحة هنا بنجاح مع عدد من خطوط، معربا عن GFP ل arabidopsis. الأهم من ذلك، وقد استخدمنا هذا الأسلوب مع خطوط التعبير عن GFP GFP إما بقوة فيالنواة، أو أكثر من ذلك بكثير ضعيفة بطريقة عصاري خلوي non-localized/diffuse، كما هو الحال مع خطوط KC464 KC274 وتستخدم هنا. كلا النوعين من خطوط متوافقة مع أسلوب وتسفر الكسور عالي التخصيب من GFP، معربا عن protoplasts (الشكل 2 و 3). يمكن أن يكون وسيلة تكيف بسهولة مع fluorophores الأخرى، على الرغم من يجب تحديد fluorophore لمضان التي تختلف كثيرا عن تألق ذاتي من الخلايا الميتة / الموت من أجل الحفاظ على القدرة على تحديد الخلايا الحية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> سلولاز R-10 </td><td> Melford </td><td> C8001 </td></tr><tr><td> سلولاز RS </td><td> Melford </td><td> C8003 </td></tr><tr><td> Macerozyme R-10 </td><td> Melford </td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td> سيغما الدريخ </td><td> R7397 </td></tr><tr><td> أكتينوميسين D </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A1410 </td></tr><tr><td> 70 ميكرومتر مصفاة الخلية </td><td> الصياد </td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50 ميكرومتر filcon كأس من نوع المرشحات </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

بعد الشروع في منشم ورقة، يتم التحكم تراكم الكتلة الحيوية بشكل رئيسي من قبل تكاثر الخلايا والتوسع في الأوراق 1. ومع ذلك، فإن ورقة ل arabidopsis هو جهاز معقد يتكون من العديد من أنواع مختلفة من الخلايا والهياكل عدة. في الوقت نفسه، ورقة تحتوي على خلايا النمو في مراحل مختلفة من التنمية، مع خلايا أبعد من كونها أول سويقات لوقف توسيع والخضوع الشيخوخة 1. خلايا مختلفة داخل ورقة يتم تقسيم لذلك، أو التمطيط تمييز؛ بالموقع، وشدد أو ميتا، و / أو الاستجابة للمحفزات في مجموعات فرعية من نوعها الخلوية في أي وقت من الأوقات. هذا يجعل الدراسة الجينومية تحديا للأوراق: على سبيل المثال عند تحليل البيانات من أوراق التعبير كلها، إشارات من شبكات الوراثية العاملة في مناطق متميزة استجابة الخلوية أو أنواع الخلايا سوف يكون مرتبك، مما أدى إلى الملف غير دقيقة التي يتم توليدها. لمعالجة ذلك، قوقد وصفت وسائل everal الدراسات التي تمكن من التعبير الخلية الجينات المحددة. وتشمل هذه الليزر التقاط تسليخ مجهري (LCM) 2 أو النباتات GFP التعبير المستخدم لتوليد البروتوبلازم واللاحقة مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 3،4، ونظام وصف مؤخرا INTACT لهطول الأمطار النووية 5 و مناعي من polysomes 6. وقد استخدمت بنجاح لFACS عدد من الدراسات، بما في ذلك تبين أن هوية الخلية والمسافة من قمة الجذر كان لها تأثير كبير على ملامح التعبير من عدد كبير من الجينات 3،7. كما تم FACS GFP من خطوط الخلايا المستخدمة لإثبات محددة خلال تنظيم النسخي الردود النيتروجين الجذر الوحشي والتنمية الجذرية 8، 9 توزيع الملح الإجهاد أوكسين في جذر 10 و لإنشاء خريطة التعبير الجيني من النسيج الإنشائي القمي ل arabidopsis تبادل لاطلاق النار 11. رغم أنوقد سبق FACS تستخدم لفرز أوراق protoplasts ل arabidopsis المستمدة يعتمد على تألق ذاتي 12،13، وقد تم حتى الآن استخدام FACS على خطوط التعبير عن GFP ل arabidopsis في أوراق محدودة جدا 4. في البروتوكول وصفنا التالية طريقة للحصول على ورقة protoplasts ل arabidopsis التي تتوافق مع FACS مع التقليل من تأثير البروتوبلازم نظام الجيل. نحن لشرح طريقة استخدام خط ل arabidopsis KC464، التي ترتبط صريح بناء GFP في البشرة متجه نحو المحور 14، السطر KC274، التي تعبر عن GFP في الأنسجة الوعائية (14) والخط ل arabidopsis TP382، والتي تعبر عن ضعف GFP إلى إشارة توطين النووية في الخلايا حارس (البيانات لا تظهر؛ الشكل 2). نحن نستخدم هذه الطريقة في الوقت الحالي لدراسة كل خلية من نوع التعبير محددة خلال تطوير والإجهاد، فضلا عن السكان غير متجانسة الخلايا في مراحل مختلفة من الشيخوخة.

وهناك طريقة لإنتاج<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; أوراق protoplasts التي تتوافق مع مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS)، مما يسمح للدراسات السكان خلية معينة. هذا الأسلوب هو متوافق مع أي<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; الخط الذي يعبر عن GFP في مجموعة فرعية من الخلايا.

بعد بدء تكوّن بادئة الورقة، يتم التحكم في تراكم الكتلة الحيوية بشكل أساسي من خلال تكاثر الخلايا وتمددها في الأوراق1. ومع ذلك، فإن ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مجموعة من البروتوبلاستات النوعية لأنواع خلوية محددة من الورقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال زراعة نباتات تعبر عن GFP في أنواع خلوية محددة في الورقة. وتتمثل الخطوة الثانية في حصاد الأوراق وتوليد البروتوبلاستات باستخدام الهضم الإنزيمي.بعد ذلك، يتم ترشيح البروتوبلاستات وفرزها باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). وتتمثل الخطوة النهائية في تأكيد دقة الفرز باستخدام المجهر الفلوري. وفي النهاية، يمكن استخدام البروتوبلاستات المفرزة لتحليل التعبير الجيني النوعي لكل نوع من الخلايا، أو التحليل البروتومي، أو التوصيف الأيضي.لقد استُخدم فرز الخلايا المنشط فلورياً بنجاح سابقاً في الجذور، ولكن يتم استخدامه هنا لعزل خلايا الأوراق. لقد كان الوسم بـ GFP قبل تطبيق هذه الطريقة محدوداً بسبب التداخل الناتج عن فلورة الكلوروفيل. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث أن التحضير السريع والدقيق للعينة ضروري لتقليل التغيرات الفسيولوجية الواسعة التي يمكن أن تحدث أثناء عملية فرز الخلايا.بشكل عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأنهم لن يكونوا على دراية بكيفية إعداد جهاز فرز الخلايا أو كيفية التأكد من دقة عملية الفرز. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الأنظمة النباتية. وتكمن المشكلة في تحديد شبكات تنظيم الجينات في أعضاء متعددة الخلايا ومعقدة مثل الورقة، في أن أنواع الخلايا المختلفة تعبر عن مجموعات مختلفة من الجينات.تُفقد هذه المعلومات الجينية في تحليل الحصاد لورقة كاملة توضح الإجراء. سيكون برفقتي إليسون أس وسانجيف كومار، اللذان يقدمان الدعم الفني لهذا العمل في مختبرنا. أولاً، املأ طبق بتري دائرياً بقطر 9 cm بـ 20 mL من المحلول A الذي يحتوي على إنزيمات الترسيب الأولي ومثبطات النسخ وRNAs.بعد ذلك، قم بجمع مادة الأوراق المطلوبة للعينات التي تحتوي على أكثر من ورقة واحدة، مثل العينة الموضحة هنا. رتّب الأوراق في كومة تصل إلى 15 ورقة. ثم استخدم شفرة حلاقة لتقطيع الأوراق إلى شرائح بعرض 1 mm.انقل شرائح الأوراق فوراً إلى أطباق بتري باستخدام ملقط مسطح، وافصل الشرائح برفق، ثم قم بإجراء الارتشاح بالتفريغ (vacuum infiltrate) للعينات مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك، ضع طبق بتري على هزاز مداري مضبوط على 90 RPM في درجة حرارة الغرفة واترك عينات البروتوبلاست لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات. وخلال فترة التحضين، استخدم الملقط لفصل شرائح الأوراق عن بعضها البعض على فترات زمنية كل نصف ساعة.بعد عملية الهضم، قم بترشيح محلول البروتوبلاستات برفق عبر مصفاة خلايا بقطر 70 micron في أنبوب سعة 50 milliliter. ستعمل المصفاة على احتجاز شرائح الأوراق لإزالتها، بينما تمر البروتوبلاستات من خلالها.استخدم الآن 4 mL من المحلول A لشطف شرائط الأوراق برفق، مع تجميع سائل الغسيل في أنبوب سعة 50 mL. بعد ذلك، انقل معلق البروتوبلاستات إلى أنابيب ذات قاع مستدير، وقم بطرد البروتوبلاستات مركزياً لمدة خمس دقائق عند 300 ×g وفي درجة حرارة الغرفة. مع الحرص على عدم تعكير الراسب، اسحب أكبر قدر ممكن من السائل الطافي برفق، ثم اغسل البروتوبلاستات باستخدام 5 mL من المحلول A تحت نفس ظروف الطرد المركزي.أخيراً، بعد إزالة الطافي العلوي، استخدم طرف ماصة P 1000 مقطوعاً لإعادة تعليق الـ PROTOPLASTS في حجم مناسب من المحلول A قبل عملية الفرز مباشرة. استخدم طرف ماصة P 1000 غير مقطوع لتفكيك أي تكتلات في محلول الـ Protoplasts. ثم قم بفصل الخلايا بشكل أكبر عن طريق ترشيح الـ protoplasts في أنبوب الفرز باستخدام مرشح fillon بمسامية 50 micron.ثم قم بتخفيف محلول الخلايا حسبما يلزم لتجنب انسداد فوهة سحب الخلايا. بعد تحديد الظروف المثلى لسحب الخلايا، قم بتحديد البروتوبلاست الموجبة لـ GFP باستخدام ليزر Argonne بطول موجي 488 نانومتر مع مقارنة المخرجات من مرشح تمرير النطاق 580 30 مقابل مرشح تمرير النطاق 530 40. لاحظ أن البروتوبلاست الموجبة لـ GFP ستظهر في المجموعة ذات القيمة العالية لـ 530 والقيمة المنخفضة لـ 580.مع وجود البروتوبلاست غير الفلورية (غير GFP) في مجموعة الـ 530 المنخفضة والـ 580 المنخفضة، تظهر البروتوبلاست الميتة والمحتضرة والحطام في مجموعة الـ 580 المرتفعة؛ ولغرض تصور البروتوبلاست المفروزة باستخدام المجهر الفلوري، يتم فرز البروتوبلاست مباشرة في ثمانية أحجام على الأقل من المحلول A، ثم تُركز البروتوبلاست بعد الفرز عن طريق الطرد المركزي. يمكن فرز البروتوبلاست في ثمانية أحجام من المحلول A وجمعها للتصور عبر المجهر الفلوري للتحقق من الإثراء. تُظهر هذه الصورة الأولى مثالاً لإثراء الخط الخلوي TP 382، الذي يعبر عن GFP في الخلايا الحارسة. وتلخص هذه الجداول أمثلة على العوائد التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة قبل التضخيم وبعده.تعتبر الكميات التي تتراوح بين 500 picograms و50 nanograms كافية للتضخيم باستخدام نظام ovation PICO WTA والتحليل اللاحق بواسطة quantitative PCR أو next generation sequencing أو microarray. وتظهر هذه السلسلة التالية من الصور خطوط خلايا بروتوبلاست متنوعة تم عزلها وفرزها وفقاً للطريقة الموصوفة للتو. وقد اشتُقّت هذه البروتوبلاست الأولى من أوراق KC 2 74، وهو مقطع عرضي لـ KC 2 74.تظهر الورقة أن بروتين GFP يتم التعبير عنه في الأنسجة الوعائية. وقد تم عزل هذه البروتوبلاست من أوراق KC 4 64، ويظهر المقطع العرضي لورقة KC 4 64 أن التعبير عن GFP يوجد في بشرة A dal. وأخيراً، تم اشتقاق هذه البروتوبلاست من أوراق TP 3 82 في أوراق TP 3 82.يتم التعبير عن بروتين GFP في الخلايا الحارسة هنا. تظهر مخططات النقاط النموذجية للاستحواذ على البيانات والتي توضح المخرجات من مرشحات تمرير النطاق 5 80 30 نانومتر مقابل مرشحات 5 30 40 نانومتر. وبوابة الفرز الموضحة هي تلك المستخدمة عادةً أثناء عملية الفرز.يوضح مخطط النقط هذه في البداية للبروتوبلاست المستمدة من أوراق نبات col4 والتي تم تحضيرها في غياب المثبطات وجود مجموعة واحدة ذات فلورة منخفضة عند 530 ومنخفضة عند 580. بينما يظهر مخطط النقط هذا للبروتوبلاست المستمدة من أوراق نبات col4 من النوع البري والتي تم تحضيرها في وجود المثبطات الإزاحة في فلورة 580 التي تحدث نتيجة للإجهاد والتلوين الناجم عن المثبطات. وتعود مخططات النقط هذه إلى بروتوبلاست مستمدة من أوراق السلالات KC 74 و KC 4 64 و TP 3 82 على التوالي.كما تم تحليل هذه العينات في وجود مثبطات، مما أظهر أن GFP يتركز في المجموعات ذات القيمة العالية 530 والقيمة المنخفضة 580. وفي هذه التجربة الممثلة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، تم الحصول أولاً على عينات لكل نوع من أنواع الأجزاء. ثم تم تضخيم العينات باستخدام نظام ovation PICO WTA وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.تم استخدام بادئات متخصصة لـ GFP. القيم الموضحة هي أعلى القيم باللون الأحمر وأدناها باللون الأخضر، وتتم الإشارة إلى متوسط القيم أو القيم الفردية باستخدام actin two كجين مرجعي بواسطة الأشرطة الصفراء الأفقية. تمثل النتائج إعادة تحقق من التقييمات الضوئية لمحتوى GFP في الأجزاء المفروزة.أظهرت المجموعة ذات الـ 530 العالية والـ 580 المنخفضة أعلى مستويات قابلة للقياس من تعبير GFP. وبينما أظهرت المجموعة ذات الـ 530 العالية والـ 580 العالية تعبير GFP أقل بنحو 1000 ضعف، أظهرت المجموعات ذات الـ 530 المنخفضة والـ 580 المنخفضة، والـ 530 المنخفضة والـ 580 العالية، مستويات منخفضة من تعبير GFP كانت قابلة للمقارنة مع مستويات مجموعة الضابطة من الورقة الكاملة ومجموعات البروتوبلاست غير المفروزة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون أربع إلى خمس ساعات من النبات وصولاً إلى مجموعة الخلايا المفروزة إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر مراقبة جهاز فرز الخلايا باستمرار وإعادة معايرته إذا لزم الأمر من أجل الحفاظ على دقة الفرز.تم العثور على هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل المصفوفات الدقيقة (microray analysis) من أجل مقارنة ومقابلة مستويات التعبير الجيني في أنواع مختلفة من الخلايا. والآن، بعد تطوير هذه التقنية، نقوم بتحليل التعبير الجيني في أنواع محددة من خلايا الأوراق في مراحل نمو مختلفة، وسنقوم بمقارنة ذلك بالبيانات المستمدة من الورقة كاملة والتي تم إنتاجها في مشروع العلوم الزراعية.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل أنواع الخلايا المفردة من الأوراق باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

cell-specific-analysis-arabidopsis-leaves-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويتجلى طريقة لعزل أنواع معينة من الخلايا من المواد النباتية. تستخدم هذه التقنية خطوط علامة المعدلة وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية أنواع الخلايا وجه الخصوص ، والإسفار الخلوية تفارق الفرز الخلية المنشط. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأسيس الإعداد النمو هنا تسهل...

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

ويجري التحقيق في الأساس الجزيئي للمكانية محددة ردود فيتوكروم استخدام النباتات المعدلة وراثيا التي تظهر الأنسجة والأعضاء القصور فيتوكروم محددة. عزل خلايا معينة العارضة التي يسببها استنزاف حامل اللون فيتوكروم التي الإسفار المنشط الخلية فرز تليها تحليلات ميكروأري يجري استخدامها لتحديد الجينات المسؤولة عن ردود فيتوكروم مكانية محددة.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

نحن تصف استخدام perfluorodecalin كوسيط الارتشاحي المتزايدة. هذه هي طريقة بسيطة لتحسين عمق في...

طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

والسعي أساسية في بيولوجيا الخلية هو تحديد الآليات التي تكمن وراء هوية العضيات التي تجعل الخلايا حقيقية النواة. هنا نقترح طريقة لتحديد الجينات المسؤولة عن سلامة المورفولوجية والوظيفية من العضيات النباتية باستخدام المجهر مضان والأدوات التسلسل من الجيل التالي.

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين والهندسة المعمارية النووية.

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

يوفر العيش التصوير متحد البؤر علماء الأحياء مع أداة قوية لدراسة التنمية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل عن التصوير متحد البؤر المباشر لتطوير الزهور نبات الأرابيدوبسيس.

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

قمنا بتطوير طريقة جديدة للتعبير عن المشترك متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات للتغلب على صعوبات الطرق التقليدية. ويستفيد من استخدام بلازميد تعبير واحد يحتوي على بروتين مستقلة وظيفيا متعددة معربا عن أشرطة الكاسيت لتحقيق التعبير البروتين المشارك.

التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات

نحن تقرير طريقة بسيطة ومرنة لإجراء تصوير لايف الفلورسنت من أوراق نبات التمويل على مدى فترة ممتدة من الوقت. ونحن نستخدم نبات نبات المعدلة وراثيا معربا عن جين مراسل فلورسنت تحت سيطرة المروجين المتعلقة بالحصانة كمثال لفهم الاستجابات المناعية مصنع الزمانية المكانية.

أسلوب متعدد الاستخدامات لتركيب نبات يترك لتصوير الوقت الفاصل بين إينترافيتال

تبشر جدوى وفعالية طرق scRNA-seq عالية الإنتاجية بعصر الخلية الواحدة في أبحاث النبات. يظهر هنا إجراء قوي وكامل لعزل أنواع معينة من خلايا جذر Arabidopsis thaliana وبناء مكتبة النسخ اللاحقة وتحليلها.

عزل وتحليل النسخ لأنواع الخلايا النباتية

يتم تقديم العديد من الطرق الشائعة الاستخدام هنا لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء لمستقبلات غشاء البلازما كيناز. تصف هذه المخطوطة البروتوكولات التفصيلية بما في ذلك تحضير المواد النباتية والمعالجة الدوائية وإعداد التصوير متحد البؤر.

الطرق القائمة على الصور لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء في خلايا سلالة الثغور

تعلم عزل البروتوبلاستات من أوراق Arabidopsis باستخدام الفرز الخلوي المنشط بالفلورسنت لدراسة التعبير الجيني في أنواع خلايا محددة. تتيح هذه التقنية تحليل البروتوميات والتشخيص الأيضي بدقة عالية.

تحليل خلية معينة من

استكشف المزيد من الفيديوهات