تحليل خلية معينة من ل arabidopsis يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مجموعة من البروتوبلاستات الخاصة بنوع الخلية من الورقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة النباتات الأولى التي تعبر عن GFP في أنواع معينة من الخلايا في الورقة. الخطوة الثانية هي حصاد الأوراق وتوليد البروتوبلاست باستخدام الهضم الأنزيمي.

بعد ذلك ، يتم ترشيح البروتوبلاستات وفرزها باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة أو الحقائق. الخطوة الأخيرة هي تأكيد دقة الفرز باستخدام الفحص المجهري الفلوري. في النهاية ، يمكن استخدام البروتوبلاستات المصنفة لتحليل التعبير الجيني المحدد لنوع الخلية ، أو التحليل البروتيني ، أو التنميط الأيضي.

تم استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت سابقا بنجاح للجذور ، ولكنه يستخدم لعزل خلايا الأوراق. تم تسمية GFP قبل هذه الطريقة بأنها محدودة بسبب التداخل الناتج عن مضان الكلوروفيل. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية بسرعة ، ولكن التحضير الدقيق للعينة أمر بالغ الأهمية لتقليل التغيرات الفسيولوجية الواسعة النطاق التي يمكن أن تحدث أثناء فرز الخلايا.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم لن يكونوا على دراية بكيفية إعداد فارز الخلايا أو كيفية تأكيد الفرز الدقيق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الأنظمة النباتية. تكمن مشكلة تحديد شبكات تنظيم الجينات في أعضاء معقدة متعددة الخلايا مثل الورقة في أن أنواع الخلايا المختلفة تعبر عن مجموعات مختلفة من الجينات.

يتم فقدان هذه المعلومات الجينية في تحليل الحصاد لورقة كاملة مما يدل على الإجراء. إلى جانبي سيكون إليسون أ وسانجيف كوما ، اللذان يقدمان الدعم الفني لهذا العمل في مختبرنا. أولا ، املأ طبق بتري دائري يبلغ طوله تسعة سنتيمترات ب 20 مل من المحلول A الذي يحتوي على إنزيمات الطلاء الأولي ومثبطات النسخ والحمض النووي الريبي.

ثم احصد مادة الأوراق المطلوبة للعينات التي تحتوي على أكثر من ورقة واحدة مثل العينة الموضحة هنا. رتب الأوراق في كومة تصل إلى 15 ورقة. ثم استخدم شفرة حلاقة لتقطيع الأوراق إلى شرائح بعرض ملليمتر واحد.

انقل شرائح الأوراق على الفور إلى طبق بتري باستخدام زوج من الملقط المسطح ، وافصل الشرائط برفق ثم تسلل العينات بالمكنسة الكهربائية مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، ضع طبق بتري على شاكر مداري مضبوطة على 90 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة وعينات من الجص الأولي لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. أثناء الحضانة ، استخدم الملقط لفصل شرائط الأوراق عن بعضها البعض كل نصف ساعة.

بعد الهضم ، قم بتصفية محلول البروتوبلاست برفق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب سعة 50 مل. لإزالة شرائط الأوراق ، سيتم الاحتفاظ بالشرائط. سوف يتم ترشيح البروتوبلاستات.

استخدم الآن أربعة ملليلتر من المحلول A لشطف شرائح الأوراق برفق ، وتجمع الغسيل في أنبوب سعة 50 مل. ثم انقل تعليق البروتوبلاست إلى أنابيب قاعية مستديرة وقم بالطرد المركزي للبروتوبلاست لمدة خمس دقائق عند 300 مرة G ودرجة حرارة الغرفة. مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات ، قم بشفط أكبر قدر ممكن من الطبقة المستلقية برفق ، ثم اغسل البروتوبلاست بخمسة ملليلتر من المحلول A في نفس ظروف أجهزة الطرد المركزي.

أخيرا ، بعد إزالة natant ضعيف ، استخدم طرفا مقطوعا P 1000 لإعادة تعليق PROTOPLASTS في حجم مناسب من المحلول A للفرز مباشرة قبل الفرز. استخدم طرف P 1000 غير مقطوع لتفكيك أي كتل في محلول Protoplasts. قم بفصل الخلايا عن طريق تصفية البروتوبلاستات في أنبوب مصدر من خلال مرشح fillon 50 ميكرون.

ثم قم بتخفيف محلول الخلية حسب الاقتضاء لتجنب انسداد فوهة مصادر الخلية. بعد تحديد الظروف المثلى لمصادر الخلايا ، حدد Proto plus الإيجابي ل GFP باستخدام ليزر Argonne 488 نانومتر الذي يجمع الإخراج من مرشح تمرير 580 30 Band مقابل مرشح تمرير 530 40 نطاق. لاحظ أن البروتوبلاست الإيجابي ل GFP سيظهر في ارتفاع 530 ، 580 منخفضا.

مع البروتوبلاستات غير GFP في 530 منخفضة ، 580 سكانية منخفضة ، تظهر البروتوبلاستات الميتة والحطام في السكان البالغ عددهم 580 لتصور البروتوبلاستات المصنفة عن طريق المجهر الفلوري ، فرز البروتوبلاستات مباشرة إلى ثمانية أحجام على الأقل من المحلول A بعد فرز التركيز ، يمكن فرز البروتوبلاستات بواسطة البروتوبلاستات بالطرد المركزي إلى ثمانية مجلدات من المحلول A وجمعها للتصور على مجهر مضان للتحقق من التخصيب. تظهر هذه الصورة الأولى مثالا على إثراء خط خلية TP 382 ، والذي يعبر عن GFP في خلايا الحراسة. يتم تلخيص أمثلة على الغلة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة قبل وبعد التضخيم في هذا الجدول.

الكميات التي تم الحصول عليها بين 500 بيكوغرام إلى 50 نانوغرام كافية للتضخيم بواسطة نظام PICO WTA والتصفيف التكميلي والتحليل اللاحق عن طريق تسلسل الجيل التالي من PCR الكمي أو المصفوفة الدقيقة. تظهر هذه السلسلة التالية من الصور العديد من خطوط خلايا البروتوبلاست المعزولة والمصنفة حسب الطريقة الموصوفة للتو. تم اشتقاق هذه البروتوبلاستات الأولى من KC 2 74 ، وتترك مقطعا عرضيا من KC 2 74.

تظهر الورقة أن GFP يتم التعبير عنه في الأوعية الدموية. تم عزل هذه البروتوبلاستات من KC 4 64 ورقة ويظهر المقطع العرضي لورقة KC 4 64 أن تعبير GFP موجود في البشرة A dal epidermis. أخيرا ، تم اشتقاق هذه البروتوبلاست من TP 3 82 ورقة في TP 3 82 ورقة.

يتم التعبير عن GFP في خلايا الحراسة هنا. يتم عرض مخططات نقطية نموذجية لاقتيازة الفاكس توضح الإخراج من 5 80 30 نانومتر مقابل مرشحات تمرير النطاق 5 30 40 نانومتر. بوابة الفرز المعروضة هي تلك المستخدمة عادة أثناء الفرز.

تظهر قطعة الأرض الأولى هذه من البروتوبلاستات المشتقة من أربع أوراق من الفحم الملصقة في غياب المثبطات 530 ، 580 سكانا منخفضا. في حين أن هذه القطعة النقطية من الفحم البري من أربع أوراق مشتقة من البروتوبلاست الملصقة في وجود مثبطات توضح التحول في 580 مضان يحدث بسبب الإجهاد والتلوين الناجم عن المثبطات. هذه المخططات النقطية هي من البروتوبلاستات المشتقة من الأوراق من خطوط KC السبعة أربعة و KC 4 64 و TP 3 82 على التوالي.

تم تلبيس هذه العينات أيضا في وجود مثبطات تظهر أن GFP يحتوى عليها في 530 مجموعة سكانية منخفضة 580. بالنسبة لهذا الممثل ، تم الحصول أولا على عينات تجربة PCR الكمية لكل نوع من أنواع الكسر. ثم تم تضخيم العينات باستخدام نظام التصفيق PICO WTA و PCR الكمي.

تم إجراء استخدام بادئات GFP محددة. القيم المعروضة هي الأعلى باللون الأحمر والأدنى في المتوسط الأخضر أو يشار إلى القيم الفردية باستخدام الأكتين اثنين كجين مرجعي بواسطة الأشرطة الصفراء الأفقية. النتائج هي إعادة التحقق من التقييمات البصرية لمحتوى خلية GFP في الكسور التي تم فرزها.

أظهر 530 منخفضا من السكان أعلى مستويات قابلة للقياس من تعبير GFP. في حين أن 530 مرتفعا من السكان الذين أظهروا حوالي 1000 ضعف تعبير GFP أقل ، فإن 530 المنخفضة و 580 المنخفضة و 530 المنخفضة 580 أظهرت مستويات منخفضة من تعبير GFP التي كانت مماثلة لتلك الموجودة في الورقة الكاملة للتحكم ومجموعات البروتوبلاست غير المصنفة بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربع إلى خمس ساعات من النبات إلى الخلايا المصنفة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبة فارز الخلايا باستمرار وإعادة معايرته إذا لزم الأمر من أجل الحفاظ على دقة الفرز.

وجدت هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل الأشعة الدقيقة من أجل مقارنة وتباين مستويات التعبير الجيني في أنواع الخلايا المختلفة. الآن بعد أن تم تطوير هذه التقنية ، نقوم بتحليل التعبير الجيني في أنواع معينة من خلايا الأوراق في مراحل نمو مختلفة ، وسنقارن ذلك بالبيانات من الورقة بأكملها التي تم إنشاؤها في مشروع الهندسة الزراعية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل أنواع الخلايا المفردة من الأوراق باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة.