تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

الهدف من هذا الإجراء هو تصور استجابات الخلايا المناعية للسموم البكتيرية. أولا ، يتم التعبير عن السم وتنقيته من خلايا الذهب BL 21. بمجرد تأكيد نشاط السم وتركيزه ، يتم توصيل السم إلى الخلايا المناعية.

باستخدام حاقن دقيق وفحص مجهري للخلايا الحية عالية السرعة. يكشف تحليل الصور الناتجة عن حركية استجابات الخلايا المناعية في الوقت الفعلي للسم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة ، مثل آلية تنشيط الالتهابات.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاستجابات الخلايا المناعية بوساطة السم ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على محفزات أخرى بما في ذلك الجرارات الكيميائية. لدينا أولا فكرة هذه الطريقة عند دراسة تفاعل البكتيريا مع الخلايا المناعية المستنبتة ولاحظنا تفاعلات متغيرة للغاية بين البكتيريا والخلايا المناعية. ابدأ في تنقية البكتيريا العقدية ليسين O أو SLO باستخدام ثقافة خلايا الذهب BL 21 التي تحتوي على PAG ثلاثة SLO.

نما البلازميد الخاص به إلى OD يبلغ حوالي 0.6. للحث على التعبير عن البروتين ، أضف خمسة ملليلتر من 20٪ من أنظمة التشغيل إلى المزرعة ورجها عند 2 25 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك ، انقل البكتيريا إلى زجاجة طرد مركزي سعة 500 مل.

ثم قم بتدوير المزرعة عند 12 ، 000 مرة G لمدة 12 دقيقة من أربع درجات مئوية بعد صب الدوران. يقوم supinate بتخزين الحبيبات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل أو لفترة أطول إذا لزم الأمر. لتنقية SLO المعبر عنه ، أضف 10 ملليلتر من محلول الغسيل المكمل ب Triton X 100 lysozyme و phenyl methyl sulfuryl fluoride إلى ماصة الحبيبات المجمدة لأعلى ولأسفل لمدة 15 دقيقة تقريبا.

إلى Resus ، قم بتعليق الحبيبات مع إبقاء العينة على الجليد. انقل الحبيبات المعلقة إلى أنبوب بولي بروبيلين دائري القاع سعة 50 ملليلتر. قم بإجراء صوتنة للمحللة باستخدام مسبار صوتي بنسبة 40٪ خمس مرات لمدة 30 ثانية لكل منها على فترات 30 ثانية مع 30 ثانية على الجليد بينهما.

ثم قم بتدوير محللة الصوتيات عند 39 ، 000 مرة G لمدة 20 دقيقة من أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، أضف البكتيريا إلى مليلتر واحد من النيكل المغسول NTA. احتضان النيكل NTA aros والتحلل معا لمدة 2.5 ساعة عند أربع درجات مئوية مع رج لطيف بعد الحضانة.

حبيبات الخرز عن طريق الدوران عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. لاحظ أن جميع عمليات الغسيل والشطف الإضافية يتم إجراؤها باستخدام إعدادات الطرد المركزي هذه وأقل من ذلك ملاحظة. بعد الطرد المركزي.

اجمع بين 30 ميكرولترا من السوبينات مع 10 ميكرولتر أربع مرات من عينة SDS في أنبوب طرد مركزي صغير واحفظه على الجليد لتحليل النقاء. ثم تخلص من ما تبقى من عامل الاستلقاء واغسل الخرزات أربع مرات في مخزن مؤقت لغسل القمل. وبمجرد الاهتمام بالطرد المركزي للملح العازل بين كل غسلة من هذه النقطة فصاعدا ، تأكد من إبقاء العينة على الجليد في جميع الأوقات.

SLO هو بروتين حساس للغاية للأكسدة والاختزال وسيفقد نشاطه بسرعة إذا كان دافئا إلى 37 درجة مئوية ، حتى لو كان لفترة قصيرة من الزمن. لتصفية بروتين SLO ، أضف ملليلتر واحد من محلول الشطف وخمسة ميكرولترات من DTT مولار واحد إلى الخرز ، واحتضنه على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم جهاز الطرد المركزي وجمع supinate في أنبوب fuge المسمى بالرقم elucian.

كرر هذه العملية ثلاث مرات ثم لاستنفاد السموم الداخلية من بروتين SLO ، أضف 200 ميكرولتر من الخرز الزراعي المترافق المغسول ، وعازلة الملح المعلقة للعينة ورجها عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم تدور عند 10 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، اجمع المادة الطافية في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة تحمل علامة تجارية.

اجمع بين 30 ميكرولترا من كل شطف مع 10 ميكرولترات ، أي أربع مرات المخزن المؤقت لعينة SDS. لتحليل صفحة SDS، قم بتخزين حلول SLO على الجليد. حدد تركيزات البروتين ونشاط انحلال الدم إذا كان مرضيا ، اسحب SLOE في خمسة إلى 10 ميكرولتر quats ، ثم قم بتجميدها على الثلج الجاف وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

ثم حدد التحلل المحدد. ريس. قم بتعليق الخلايا المراد اختبارها مرتين. قم بتوسيط الخلايا الست لكل مليلتر في المخزن المؤقت RB مع 20 ميكروغرام لكل مليلتر.

يوديد بروبيديوم. هنا يتم اختبار خلايا T 27 A. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من الصفيحة السفلية 96 بئر V في أنابيب منفصلة للطرد المركزي الصغير.

قم بتخفيف SLO بشكل متسلسل إلى ضعف التركيز النهائي في المخزن المؤقت rb. ثم أضف إما 100 ميكرولتر من السم أو 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت RB إلى الخلايا واحتضنه لمدة خمس دقائق من 37 درجة مئوية. تتراوح التركيزات النهائية النموذجية من 2000 وحدة لكل مليلتر إلى 31.25 وحدة لكل مليلتر.

قم بتشغيل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي وجمع البيانات باستخدام مرشحات ل fi أو cethrin أو pe. يمثل إزاحة السجل الفردية الخلايا القابلة للاختراق بشكل عابر بينما يشير إزاحة السجل الثلاثي إلى الخلايا الميتة. احسب التحلل النوعي للخلايا عن طريق طرح النسبة المئوية للخلايا الميتة في التجربة من التجربة باستخدام المعادلة الموضحة هنا قبل يوم واحد من لوحة التجارب ، مرتين توسيط البلاعم الخمسة على الزجاج المطلي بالكولاجين.

أطباق 35 ملليمتر السفلية. يجب أن يكون المجهر المستخدم في توصيل السموم مزودا بمرحلة مقلوبة ، ومرحلة ساخنة ، ومكعبات مرشح انبعاث الإثارة المناسبة ، وعدسة بيرتاند إذا كانت متاحة. أصعب جزء في هذا الإجراء هو إحضار الإبرة سليمة إلى الخلايا.

لضمان النجاح ، نستخدم عدسة برتراند ، والتي تستخدم عادة للمحاذاة لتصور الإبرة أثناء إحضارها عبر المستويات البؤرية. يجب توصيل المجهر بحاقن دقيق ويجب التحكم فيه بواسطة جهاز كمبيوتر مزود بذاكرة كافية لجمع البيانات وتخزينها ، وتشغيل المجهر والحاقن الصغير والسماح لوقت المرحلة الساخنة بالتسخين إلى 37 درجة مئوية أثناء انتظار تسخين المرحلة. قم بتسمية الخلايا لمدة 30 دقيقة بصبغة عند 37 درجة مئوية.

اعتمادا على المقايسة ، يمكن إجراء العلامات بخمسة ميكرولترات ، أربعة أو 2:00 صباحا في مليلتر واحد ، HBSS أو اثنين من ميكرولتر الكالسيوم في وسط كامل واحد هنا ، يتم استخدام أربعة أو اثنين. قم بإزالة وسط الخلية واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. استنشق PBS واستبدله بملليلتر RPMI واحد مكمل بكلوريد الكالسيوم المليمولي.

قم بتركيب الطبق على المجهر ، واجعل الخلايا في التركيز باستخدام المجال الساطع ، ثم اضبطه للتركيز قليلا فوق الخلايا. بعد ذلك ، امزج ميكرولتر واحد من توكسين SLO أربعة ميكرولتر ، و 10 ملليغرام لكل مليلتر ، و DEXTRA 5 55 وستة ميكرولتر من الماء. ثم قم بجهاز الطرد المركزي 20 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق من أربع درجات مئوية.

يستخدم Dextern للتحقق من أن طرف الفيمتو غير مسدود باللون G. استخدم لودر صغير لتحميل ميكرولترين من السم المخفف في طرف الفيمتو من الخلف. قم بتحميل طرف الفيمتو على الحاقن الصغير.

ثم اضبط زاوية الحاقن بحيث يجلس الطرف فوق مركز الخلايا مع مساحة للتحرك في جميع الاتجاهات ، ومسح الإعدادات السابقة لحد Z الذي يحد من مدى انخفاض طرف الحاقن الصغير. اضبط الحاقن الصغير على الحقن لمدة 0.5 ثانية عند 120 رطل لكل بوصة مربعة مع ضغط خلفي يبلغ 20 رطل لكل بوصة مربعة. ثم اخفض الطرف حتى يدخل الوسط.

باستخدام عدسة برتراند. قم بتوسيط الطرف واتبع الطرف حيث يتم إنزاله بالقرب من الخلايا. بمجرد خروج الإبرة من التركيز ، عد إلى البصريات العادية.

يجب أن يكون ظل الإبرة واضحا في الحقل. ركز فوق الخلايا وخفض الإبرة حتى يتم التركيز عليها. ثم اجعل الخلايا في بؤرة التركيز وقم بإحضار الإبرة المجاورة للخلية بعناية.

بعد تحديد الحد Z للحقن ، ابدأ التصوير وحقن السم. ثم ارفع الإبرة وانتقل إلى منطقة جديدة من الخلايا. حقن مادة سامة إضافية واستمر في التصوير بعد الحقن.

انقل الإبرة إلى وضع المنزل لمنع أي تسرب غير مرغوب فيه للسموم من الإبرة باستخدام الطريقة الموضحة في هذا الفيديو ، 10 إلى سبعة إلى 10 إلى ثماني وحدات لكل مليلتر. عادة ما يتم الحصول على SLO بتركيز بروتين يبلغ أربعة ملليغرام لكل ملليلتر. يعرض جل صفحة SDS هذا عينات بكتيرية قبل وبعد تحريض السموم بعد التنقية ، ويكشف كل من تلطيخ الكاماسي الأزرق الثلاثة أن SLO المستحث قد تم تنقية بنجاح.

SLO هو النطاق عند 69 كيلودالتون لتحديد كمية السم المطلوبة لتحلل خليتين T 27 A أو D. تم تحدي الخلايا بتركيزات مختلفة من SLO لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية في وجود يوديد البروبيديوم وفحصها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم تحديد التحلل المحدد كما هو موضح هنا.

250 وحدة لكل مليلتر. يعطي SLO تحلل 50٪ لكل من خليتين T 27 A و D. ستكون جرعة التحلل الفرعية 10٪ من السم 62.5 وحدة لكل مليلتر.

هذه القيم مهمة لنشاط السموم المعياري لتقييم موت الخلايا بعد التعرض للسموم. تم تحضين الخلايا الليفية الجلدية البشرية بالكالسيوم ومثلي الأثيريوم باستخدام مجموعة ميتة حية من تقنيات الحياة. بعد التعرض الموضعي للسم البكتيري ، أنثرو لايسين O.In هذه الصورة ، يظهر الكالسيوم باللون الأخضر وبروميد الأثيريوم في المناطق الحمراء القريبة من الميكروبيوم ، ويظهر موت الخلايا الذي يتمثل في فقدان الكالسيوم وامتصاص الهوموديمر ، في حين أن المناطق البعيدة عن الطرف لن تظهر أي ضرر.

يسمح التوصيل الدقيق للسم أيضا بفحص الأحداث في الوقت الفعلي مثل تدفق الكالسيوم. تعرضت هذه الترابط المستمر البشري المحملة ب 4:02 صباحا ل SLO بمعدل تدفق ثابت مع تحول التصوير المباشر المتزامن من الأخضر إلى الأزرق. يشير اللون الزائف إلى زيادة مستويات الكالسيوم العصاري الخلوي.

يؤدي SLO إلى زيادة سريعة في الكالسيوم العصاري الخلوي ، والذي ينتشر عبر منطقة الطبق بسبب التسليم الموضعي. ومع ذلك ، فإن الخلايا القريبة فقط من طرف الحاقن الصغير تلتقي وسم المفاعل. يوضح هذا كلا من رد فعل خلوي واحد على السم والمنطقة المقيدة مكانيا لتوصيل السموم لحل الأحداث في بعد zdi.

تم الجمع بين التسليم الجزئي مع الفحص المجهري متحد البؤر ثلاثي الأبعاد عالي السرعة. تظهر هذه المجموعة من الصور الخلايا المتغصنة بعد حقن السم. تم احتضانها مسبقا مع مضاد CD 11 C مترافق إلى جهاز كمبيوتر موضح باللون الأخضر لتسمية غشاء البلازما.

كما يتضح هنا ، يتم إطلاق الحويصلات الدقيقة بعد توصيل السموم. كجزء من عملية الإصلاح الخلوي ، تتركز جزيئات السم على الفقاعات ، والتي يتم التخلص منها للقضاء على السموم. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء الفحص المجهري في 45 دقيقة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على السم باردا قبل الاختلاط بالخلايا واختبار نشاط انحلال. جيد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس حركية الخلايا المناعية في الوقت الفعلي لاستجابات الخلايا المناعية للسموم البكتيرية باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية.