Name: استخراج المستضدات لفحوصات الأنسجة وظيفية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: تعلم استخراج المستضدات من الأنسجة البشرية باستخدام مزيج BAW لاختبارات وظيفية للخلايا التائية. تتيح هذه الطريقة قياس استجابات الخلايا التائية بدون مذيبات سامة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويدعم هذا العمل من المنح المقدمة من الصحة الوطنية الاسترالية ومجلس البحوث الطبية (NHMRC # 559007) والأحداث السكري مؤسسة أبحاث (JDRF 4-2006-1025) ومخطط البنية التحتية التشغيلية لحكومة فيكتوريا. نشكر أعضاء ماندل توم برنامج زرع جزيرة عزل فريق جزيرة لتوفير الأنسجة البشرية. تم جمع الأنسجة البشرية واستخدامها مع الموافقة الأخلاقية المحلية (مستشفى سانت فنسنت HREC-A 011/04 والصحة سانت فنسنت HREC-A 135/08).

1. إعداد الأنسجة الطحال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن يعامل الملاحظات جميع المواد التي قد تكون معدية الإنسان وينبغي أن تجري جميع الإجراءات في مجلس الوزراء من الفئة الثانية تدفق الصفحي. باستخدام مقص ملقط معقم و، وإزالة الأنسجة الدهنية والليفية من أقسام الطحال (~ 1-2 سم في حجم) وتقليم قبالة أكبر قدر من المواد كبسولة الخارجي قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة صغيرة (1-2 سم 3) من الأنسجة الطحال ووضع كل قطعة في أنبوب العقيمة 50 مل فالكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأداة الإضافية تجميد قطعة من الأنسجة عن طريق الغمر في السائل N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحل في -80 درجة مئوية. بروتوكول مماثلة مناسبة لالأنسجة الأخرى (ق). </li></ol> 2. إعداد الإنسان للجزيرة التخزين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجزر الثقافة في وسائل الإعلام CMRL. جمع الجزر في أنبوب 10 مل المخروطية وغسل أسفل مرتين في برنامج تلفزيوني بواسطة الطرد المركزي في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. صب قبالة PBS واستنزاف المخزن المؤقت المتبقية عن طريق وضع أنبوب مقلوب لفترة وجيزة على منشفة ورقية. يجب الحرص على عدملإزاحة الجزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزفت مرة واحدة، وإعادة رسملة الأنبوب والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. إعداد مستخلصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج BAW (10:30:60٪ V / V) وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنبوب من C. ° -80 ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يكفي من الجليد الباردة BAW لتغطية قطعة من نسيج الجسم. لاستخدام الجزر 3-5 مل. لاستخدام الأنسجة الطحال 10-20 مل تبعا لحجم قطعة من نسيج الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الخالط الأنسجة. تنظيف ل &#39;المجانسة &quot;10-20 مل من الايثانول 70٪ / المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجانس الأنسجة في رشقات نارية عدة، بعد وضع التحقيق في أنبوب الخالط مع الأنسجة وحل BAW. إبقاء الأنبوب في دلو الجليد بعد ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف بدقة الخالط بين العينات، من خلال التجانس 10-20 مل من الايثانول 70٪ / الماء ثم العازلة BAW. هذا يمنع انتقال التلوث من الأنسجة بين samples.Dismantleand نظيفة مع الايثانول 70٪ / من بعدنا المياهه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب مقتطف تحتوي على مواد قابلة للذوبان فقط، المتجانس أجهزة الطرد المركزي في استخراج أنسجة 4،000 دورة في الدقيقة في RT لمدة 10 دقيقة. إذا كنت بحاجة لاستخراج مزيد من النفط الخام، وتدور في 1،000 دورة في الدقيقة في RT لمدة 5 دقائق. الأسلوب الأكثر ملائمة لاستخراج البروتينات غير قابلة للذوبان BAW يعتمد على تحليل المصب من البروتينات. لاستخدامها في المقايسات المناعية الوظيفية نقترح محاولة حل جزء غير قابل للذوبان في اليوريا M 8 إذ أننا وجدنا في السابق أن هذا جيد التحمل 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف لأنبوب نظيفة ووضعها على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين في استخراج باستخدام مقايسة BCA أو ما شابه ذلك. </li></ol> 4. تجميد التجفيف مقتطفات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على كتلة المطلوبة من البروتين (أي 100 ميكروغرام لكل أنبوب)، وفقا لتخفيف جناسة والاستغناء مأخوذة في المسمى عقيمة مل 5.0، الصقر (12x75 ملم) الأنابيب. ونحن كثيرا ما تستخدم 100 ميكروغرام / الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 18-20 إبرة قياس محقنة معقمة تقديم 3 ثقوب في سقف كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد أنابيب إما عن طريق وضعها على الثلج الجاف ل10 دقيقة ~ أو في الفريزر -80 ° C للساعة 1&gt;. المحل في -80 درجة مئوية حتى على استعداد لوضع على مجفاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل أكثر جفافا للتجمد والسماح للتوازن (-100 درجة مئوية). هذا يستغرق حوالي 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهذا يتوقف على حجم، ويمكن الانتهاء تجميد التجفيف بعد 3 ساعة ولكن نترك بشكل روتيني عينات لدينا ليلة وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من دورة التجفيف، وإيقاف مضخة فراغ، والسماح ببطء الى غرفة الضغط. إزالة الحامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء محرك السيارة العقيمة، تنزع الأغطية من أنابيب مثقبة واستبدالها بأخرى جديدة (فالكون 352032). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب مخزن في -20 ° C. يمكن تشكيل العينات في وسائل الإعلام والثقافة، وأو مخازن أخرى، وتستخدم في وظيفة أو المقايسات الكيميائية الحيوية. </li></ol> 5. ممثل النتائج ويظهر الشكل 1 تلطيخ من البروتينتحميل هلام مع مقتطف من الطحال والبنكرياس جزيرة الأنسجة المنضب (المسمى عنيبية) وتنقيته الجزر الإنسان (الجزر المسماة). النتائج تظهر تمثيل جيد للبروتينات ذات الوزن الجزيئي من مختلف لكل الأنسجة. تم اختبار قدرة مقتطفات الأنسجة البشرية لتحفيز تكاثر الخلايا T-باستخدام مقايسة انتشار CFSE القائم 7 (الشكل 2). تم عزل PBMC المستخدمة في هذا الاختبار من أي فرد يعانون من مرض السكري من النوع 1. يتم التعبير عن حجم الاستجابة كنسبة من عدد الخلايا CFSE قاتمة في 5000 CD4 + الخلايا CFSE، ومشرق دون مستضد: من الخلايا CFSE قاتمة في 5000 CD4 +، وخلايا CFSE مشرقة مع مستضد ثلاث نسخ من عينات 7. النتائج تظهر ضعيفة، ولكن يمكن اكتشافها، والانتشار ردا على عنيبية (CD1 = 3.5) وأقوى استجابة لاستخراج جزيرة (6.8). يتم تضمين فيروس الأنفلونزا المعطل (CDI = 142.6) وذلكإيجابية السيطرة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> الشكل 1. هلام بروتين. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> الشكل 2. نتائج الفحص من انتشار CFSE القائم ضد عنيبية واستخراج جزيرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> .

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأننا أردنا لتوليد مقتطف من الأنسجة البشرية التي كانت خالية من المواد الكيميائية السامة مثل المنظفات. على وجه التحديد وقد استخدمنا ذلك لإعداد مقتطفات من الأنسجة البشرية التي يمكن استخدامها في فحوصات وظائف المناعة البشرية في المختبر. يمكن أيضا مقتطفات إعدادها باستخدام هذا البروتوكول في أي تشكيل العازلة والتحليلات الكيميائية الحيوية المستخدمة لكثيرة، مثل اللوني الغربية النشاف أو السائل. وهذا يجعل هذه التقنية التي تنطبق على تطبيقات المصب كثيرة. </...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 5 مل 12 × 75 مم أنابيب معقمة البوليسترين </td><td> BD الصقر </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> قبعات للأنابيب أنابيب البولي ستايرين (أعلاه) </td><td> BD الصقر </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ML أنابيب معقمة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> الأسيتونيتريل </td><td> كيماويات Mallinckradt </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-OL </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> الخالط: PRO200 </td><td> الحيوية الاستراتيجية </td><td> 01-01200 </td><td> 10 × 115 مم المنشار الأسنان مولد </td></tr><tr><td> مجفاد </td><td></td><td></td><td> Virtis، الفوق 4K </td></tr><tr><td> إبرة معقمة قياس 18-20 </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 متوسطة </td><td> سيجما </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> سيجما </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. الكواشف محددة والمعدات.

استخراج المستضدات لفحوصات الأنسجة وظيفية

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

العديد من الأهداف مستضد من الاستجابة المناعية التكيفية، معترف بها من قبل والخلايا B T، لم تعرف 1. هذا صحيح بصفة خاصة في أمراض المناعة الذاتية والسرطان 2. هدفنا هو التحقيق في مستضدات الخلايا T التي تعترف بها الإنسان في نوع 1 من داء السكري أمراض المناعة الذاتية 1،3،4،5. لتحليل خلايا T الإنسان استجابات ضد الأنسجة حيث لا تحديد مستضدات الخلايا T معترف بها من قبل وضعنا طريقة لاستخراج البروتين من مولدات المضادات الأنسجة البشرية في تنسيق متوافق مع المقايسات الفنية 6. لا يمكن أن الردود سابقا، T-خلية الأنسجة غير منقى لمقتطفات أن تقاس لأن طرق استخراج تسفر عن المحللة التي تحتوي المنظفات التي كانت سامة للخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى. نحن هنا وصف بروتوكول لاستخراج البروتينات من الأنسجة البشرية في شكل غير سامة للخلايا T الإنسان. والمتجانس النسيج في خليط من الأسيتونيتريل، butan-1-ol و واتإيه (BAW). يتم قياس تركيز البروتين في استخراج أنسجة وaliquoted كتلة معروفة من البروتين في أنابيب. بعد الاستخراج، يتم إزالة المذيبات العضوية من قبل تجفيد. ويمكن تخزين مقتطفات الأنسجة مجفف بالتجميد حتى المطلوبة. لاستخدامها في فحوصات وظائف المناعة، وتعليق من الخلايا المناعية، في وسائل الإعلام الملائمة الثقافة، يمكن إضافة مباشرة إلى استخراج مجفف بالتجميد. تم قياس بسهولة وانتشار إنتاج السيتوكينات بواسطة PBMC، ردا على مقتطفات إعدادها باستخدام هذا الأسلوب. وبالتالي، لدينا أسلوب يسمح للإعداد السريع للأنسجة البشرية لست] التي يمكن استخدامها كمصدر للمستضدات في تحليل الخلايا T-الردود. نقترح أن هذا الأسلوب سيسهل تحليل الاستجابات المناعية التكيفية في زرع الأنسجة لوالسرطان والمناعة الذاتية.

يوصف بروتوكول بسيط لإعداد مقتطفات من الأنسجة البشرية لاستخدامها كمصدر للمستضدات في المقايسات T-الخلية الوظيفية. هذا الأسلوب يسمح للقياس T-الخلية الردود على الأنسجة المشتقة من المستضدات<em&gt; في المختبر</em&gt;.

لم يتم تحديد العديد من المستضدات المستهدفة للاستجابة المناعية التكيفية، والتي تتعرف عليها الخلايا البائية والخلايا التائية 1. وينطبق هذا بشكل خاص على أمراض المناعة الذاتية...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير مستخلص نسيجي يتوافق مع المقايسات المناعية الوظيفية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع عينة من النسيج المراد دراسته، ثم تجنيس عينة النسيج في خليط من البيوتانول، والأسيتونيتريل، والماء، أو ما يعرف بـ BAW.بعد تحديد تركيز البروتين، يتم تقسيم المستخلص وتجفيفه بالتجميد لإزالة المذيبات. وفي النهاية، يُستخدم المستخلص المعاد تشكيله كمصدر للمستضد في مقاييس تكاثر الخلايا التائية البشرية أو مقاييس إفراز السيتوكين. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التحلل بالمنظفات في أن المستخلص الناتج يكون خالياً من المذيبات والمنظفات السامة.في هذا البروتوكول، يجب التعامل مع جميع المواد البشرية على أنها معدية محتملة، ويجب إجراء جميع الخطوات داخل كابينة تدفق صفائحي من الفئة الثانية. باستخدام مقص وملقط معقمين، قم بإزالة الدهون والأنسجة الليفية من مقاطع الطحال التي يتراوح حجمها بين واحد إلى اثنين سنتيمتر تقريبًا. قم بتقليم أكبر قدر ممكن من مادة المحفظة الخارجية.قطّع قطعاً صغيرة من نسيج الطحال وضع كل قطعة في أنبوب Falcon معقم سعة 50 milliliter. جمد قطع النسيج عن طريق الغمر في النيتروجين السائل وخزنها في درجة حرارة minus 80 degrees Celsius. لبدء إجراء تحضير جزر البنكرياس البشرية للزراعة التخزينية.توضع حلقات العين (eyelets) في وسط CMRL عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تُجمع حلقات العين في أنبوب مخروطي القاع سعة 10 مل باستخدام جهاز الطرد المركزي بسرعة 1,500 RPM لمدة خمس دقائق. يتم التخلص من الوسط والغسل مرتين باستخدام PBS، وبعد الغسلة الثانية.قم بسكب محلول PBS وتصريف المنظم المتبقي عن طريق وضع الأنبوب مقلوباً لفترة وجيزة على منشفة ورقية. كن حذراً لعدم إزاحة العيينات. بمجرد التصريف، أعد إغلاق الأنبوب وقم بتجميده سريعاً في النيتروجين السائل وخزنه عند درجة حرارة 80- درجة مئوية.لتحضير مستخلص نسيجي، ابدأ بإخراج الأنبوب الذي يحتوي على النسيج من درجة حرارة 80- درجة مئوية واتركه ليصل إلى درجة حرارة الغرفة. يتم تجنيس النسيج في خليط من البيوتانول والأسيتونيتريل والماء، أو ما يعرف بـ BAW، والذي تم تحضيره مسبقاً وتخزينه عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. أضف كمية كافية من BAW المبرد بالثلج لتغطية قطعة النسيج؛ وبالنسبة لنسيج الطحال المستخدم في هذا العرض التوضيحي، استخدم 10 إلى 20 milliliters من BAW.قم بتجميع مجانس الأنسجة. نظف المجانس عن طريق تجنيس 20 milliliters من الإيثانول بتركيز 70% في الماء. بعد ذلك، ضع مسبار المجانس في الأنبوب الذي يحتوي على النسيج ومحلول BAW وقم بتجنيس النسيج على دفعات متعددة.بعد ذلك، ضع الأنبوب في وعاء مناسب لمنع التلوث المتبادل للأنسجة بين العينات. نظف جهاز التجانس جيداً بين العينات عن طريق تجنيس 10 إلى 20 milliliters من ethanol بتركيز 70% في الماء، يليه استخدام BAW buffer centrifuge. يتم تجنيس مستخلص النسيج في درجة حرارة الغرفة.إذا كان المطلوب الحصول على مستخلص يحتوي على المواد الذائبة فقط، يتم الطرد المركزي بسرعة 4,000 RPM لمدة 10 دقائق. أما إذا كان المطلوب مستخلصاً أكثر خاماً، فيتم الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق، وبعد عملية الطرد المركزي، يتم نقل الطافي إلى أنبوب نظيف ووضعه على الثلج. يتم تحديد تركيز البروتين في المستخلص لاحقاً باستخدام مقايسة BCA أو مقايسة مماثلة.تتمثل الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول في قياس تركيز البروتين في المستخلص بدقة، وذلك لضمان تجفيف الحجم المناسب من المستخلص بالتجميد. وللحصول على كتلة البروتين المطلوبة عند تجفيف المستخلصات بالتجميد، يتم أولاً تخفيف المتجانس وفقاً لكتلة البروتين المطلوبة وتوزيع حصص منه في أنابيب معقمة سعة 5 مل وموسومة. في هذا المثال، تم تخصيص 100 µg من البروتين لكل أنبوب.باستخدام إبرة معقمة بقياس 18 إلى 20، اصنع ثلاثة ثقوب في غطاء كل أنبوب، ثم قم بتجميد الأنابيب بوضعها على الثلج الجاف لمدة 10 دقائق تقريباً، وقم بتشغيل المجفف بالتجميد واتركه حتى يتوازن عند درجة حرارة 100- درجة مئوية، وهو ما سيستغرق حوالي 30 دقيقة. وعندما يصبح المجفف بالتجميد جاهزاً، ضع الأنابيب بداخله وقم بتشغيل مضخة التفريغ.يمكن إكمال عملية التجفيف بالتجميد في غضون ثلاث ساعات، وذلك اعتمادًا على حجم المستخلص، على الرغم من أن العينات تُترك عادةً طوال الليل. بعد اكتمال دورة التجفيف، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ واسمح بدخول الضغط إلى الغرفة ببطء.قم بإزالة حامل الأنابيب داخل غطاء معقم. انزع الأغطية المثقبة من الأنابيب واستبدلها بأغطية جديدة. تُحفظ الأنابيب في درجة حرارة -20 °C.يمكن لاحقاً إعادة تشكيل العينات في وسط استزراع أو أوساط غذائية أو محاليل منظمة أخرى واستخدامها في مقايسات كيميائية حيوية وظيفية. يوضح هذا الشكل صبغ هلام بروتيني محمل بمستخلصات من أنسجة بنكرياسية منزوعة الجزر من الطحال، وجزر بنكرياسية بشرية منقاة. تظهر هذه النتائج تمثيلاً جيداً لبروتينات ذات أوزان جزيئية مختلفة لكل نسيج؛ وقد تم اختبار قدرة مستخلصات asana والجزر على تحفيز تكاثر الخلايا التائية البشرية باستخدام مقايسة تكاثر تم فيها وسم الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي أو PBMC بصبغة CFSE الفلورية، حيث تم قياس الخلايا التي تكاثرت استجابةً للمستضد، والتي نتج عنها انخفاض في شدة CFSE، مباشرةً عن طريق قياس التدفق الخلوي.تم عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) المستخدمة في هذا المثال من فرد مصاب بمرض السكري من النوع الأول. تم التعبير عن مقدار استجابة خلايا T كنسبة بين عدد خلايا CFSE dim لكل 5,000 من خلايا CD4 الموجبة ذات CFSE bright بدون مستضد، وعدد خلايا CFSE dim لكل 5,000 من خلايا CD4 الموجبة ذات CFSE bright مع وجود المستضد من عينات مكررة ثلاث مرات. وتظهر النتائج تكاثراً ضعيفاً ولكن يمكن اكتشافه استجابةً لـ Asana بمؤشر انقسام خلوي (CDI) قدره 3.5.كانت الاستجابة لمستخلص العيينة أقوى مع تسجيل مؤشر تحفيز سايتوكيني (CDI) بلغ 6.8، وقد تم إدراج فيروس الإنفلونزا غير النشط كعنصر تحكم إيجابي بعد هذا الإجراء. ويمكن استخدام طرق أخرى مثل Ali Spot أو e Iza للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد السايتوكينات التي يتم إفرازها استجابةً للمستضدات المشتقة من الأنسجة.

extraction-of-tissue-antigens-for-functional-assays

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوصف بروتوكول لإعداد قوي وعصائر هيلا الصغيرة النووية. هذا البروتوكول هو قيمة للفحوصات التي تتطلب استخدام المجموعات الصغيرة من الخلايا، مثل الخلايا المعالجة بالأدوية أو رني. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على طريقة طائفة واسعة من فحوصات الجينات وغيرها من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا المريض.

على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن

يوضح هذا الفيديو استخدام مقايسة ELISpot لتقييم وظيفة الخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة ، ASCs. تتفاعل الأجسام المضادة التي تفرزها ASCs مع شظايا الأجسام المضادة متعددة النسيلة المرتبطة بالغشاء ، والتي يتم اكتشافها بواسطة الأجسام المضادة IgG أو IgM المترافقة بالإنزيم. تشير البقعة الملونة المنتجة في كل بئر إلى وجود النمط الإسوي للجسم المضاد المحدد ، والذي يرتبط بالنشاط الإفرازي للخلايا البائية.

التقييم الوظيفي للخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة باستخدام اختبار ELISpot

نقدم هنا بروتوكولا محسنا ومفصلا للتلوين المناعي المزدوج في أقسام الجهاز العصبي المركزي للفئران (CNS) والعقدة الليمفاوية الطرفية (LN) المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين.

تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة

تعتمد أبحاث السرطان الانتقالية على استخراج الأنسجة البشرية. تم بذل الكثير من العمل لتحسين طرق الاستخراج لتحليل خارج الجسم الحي. هنا ، نصف طرق معالجة الأنسجة التي تسمح بإخراج أقصى قدر من البيانات من عينات محدودة.

العمل مع الأنسجة البشرية لبالحركة أبحاث السرطان

ووصف وهناك طريقة بسيطة لكنها فعالة التي توظف النانوية المغناطيسية للكشف عن وإثراء خلايا B-مستضد رد الفعل لتحليل وظيفي والمظهرية.

كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

وهنا يصف لنا أسلوب الذي يجمع في الموقع تيترامير MHC تلطيخ مع إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد الترجمة، والنمط الظاهري، وكمية محددة مستضد الخلايا في الأنسجة. هذا البروتوكول يستخدم لتحديد الخصائص المكانية والمظهرية لخلايا تي CD8 مستضد على حدة بالنسبة لنوع الخلية الأخرى والهياكل في الأنسجة.

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

عدم التطابق في الكريات البيض البشرية مستضد (هلا) تسلسل بين الهيئة المانحة والمتلقية أزواج هي السبب الرئيسي للرفض بوساطة الأضداد في زرع الأعضاء. نقدم هنا استخدام صفائف مستضد مخصصة تستند إلى هلا تسلسلات فرادى المانحين للتحقيق المضادة المانحين هلا اللوانتيبوديس في الجهاز المتلقين.

تخصيص صفائف الببتيد للكشف عن Alloantibodies هلا في زرع الأعضاء

نحن نصف طريقة تلطيخ سريعة لإجراء التصوير متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة.

طريقة سريعة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف لأقسام الأنسجة المجمدة

توفر المقايسات المناعية القائمة على الدم الكامل أداة سهلة وفعالة للموارد لتحليل المناعة الخاصة بالمستضد لأغراض التشخيص والبحث. توفر هذه المقالة بروتوكولا محسنا قائما على الدم الكامل مع تحفيز مشترك مزدوج لتحليل شامل لمناعة المضيف لمسببات الأمراض الفطرية والفيروسية ، بما في ذلك نسخة منخفضة الحجم لمرضى الأطفال الصغيرة.

فحص الدم الكامل مع التحفيز المشترك المزدوج للتحليل الخاص بالمستضد لمناعة المضيف ضد مسببات الأمراض الفطرية والفيروسية

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتحديد مجموعات الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد في رئتي الفئران من خلال إثراء الخلايا التائية القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: رباعيات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC).

تحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد من رئتي الفأر مع الببتيد: رباعيات التوافق النسيجي المعقدة الرئيسية

تعلم استخراج المستضدات من الأنسجة البشرية باستخدام مزيج BAW لاختبارات وظيفية للخلايا التائية. تتيح هذه الطريقة قياس استجابات الخلايا التائية بدون مذيبات سامة.

استخراج المستضدات لفحوصات الأنسجة وظيفية

استكشف المزيد من الفيديوهات