قياس تأثيرات على الأجسام المضادة من وظيفة الخلوية Cardiomyocytes متفرقة

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن الأجسام المضادة الموجهة للقلب في بلازما المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب التوسعي أو أمراض القلب الأخرى ذات الخلفية المناعية الذاتية. ويتم تحقيق ذلك من خلال عملية امتصاص مناعي مصغرة أولية لبلازما المريض على أعمدة كرات anti IgG لتنقية الغلوبولين المناعي G كخطوة ثانية. كما يتم عزل الخلايا العضلية القلبية البطينية من جرذان وستار البالغة لتوفير القاعدة الخلوية لهذا المقايسة الحيوية.

بعد ذلك، تُترك الخلايا العضلية القلبية لتلتصق بالشرائح الزجاجية لغطاء الغرفة وتُصبغ بـ URA 2:00 AM لتمكين مراقبة العبور العابر للكالسيوم داخل الخلايا أثناء الانقباضات، ثم يتم اختبار IgG الخاص بالمريض لمراقبة تأثيره على قدرة الخلايا العضلية القلبية على الانقباض. وتوضح النتائج ما إذا كان IgG المريض يحتوي على أجسام مضادة توجيهية بناءً على التغيرات في القدرة على الانقباض والعبور العابر للكالسيوم في الخلايا العضلية القلبية المعزولة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المقايسات المناعية القياسية للكشف عن الأجسام المضادة في أنها لا تعتمد على مستضد محدد وأنها تسمح بالتمييز بين الأجسام المضادة المحفزة والمثبطة.

سيتم استعراض الإجراء من خلال فيديو توضيحي مع الحصول على دعم فني من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، قم بتجهيز أعمدة الامتصاص المناعي الصغيرة عن طريق ملء عمود econopak فارغ بـ 3 mL من كرات anti IgG لكل 2 mL من بلازما المريض المعبأة في أنابيب EDTA. بعد ذلك، ضع مرشحاً فوق كرات anti IgG.

اقطع الطرف السفلي للعمود واضغط على المرشح للوصول إلى معدل تدفق يبلغ تقريبًا قطرة واحدة في الثانية. بعد ذلك، اغسل العمود ثلاث مرات بحجم واحد من البلازما من كلوريد الصوديوم 0.9%. قم بنقل البلازما إلى العمود وعندما تنغمر البلازما تمامًا في كرات anti IgG، اغسلها بنفس الحجم من كلوريد الصوديوم 0.9%. بعد ذلك، انقل حجمًا واحدًا من البلازما من غلايسين هيدروكلوريد بتركيز 0.2 molar عند pH 2.8 إلى العمود واتركه ينغمر في الكرات.

ثم أضف حجماً آخر من هيدروكلوريد الجليسين إلى العمود. اجمع التدفق في أنبوب سعة 15 milliliter واضبط الـ pH إلى 7.3 باستخدام tris hydrochloride بتركيز 0.5 molar عند pH 8.0 لإعادة تنشيط العمود. اغسله بثلاثة أحجام من البلازما من هيدروكلوريد الجليسين بعد غسلة نهائية بحجمين من 0.9%sodium chloride.

يمكن استخدام العمود لعينة البلازما التالية لاستخدامها على الخلايا العضلية القلبية. يجب إجراء ديالة لكسر IgG الذي تم جمعه مقابل المنظم التجريبي، وذلك أولاً عن طريق ملء كسر IgG في أنبوب غشاء ديالة من استر السليلوز بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 100 kilodaltons. ثم يوضع الأنبوب في لتر واحد من EB مع التقليب ببطء باستخدام محرك مغناطيسي عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. وبعد ثماني ساعات، يُنقل أنبوب الديالة إلى ثلاثة لترات من EB طازج وتُجرى الديالة لمدة 20 ساعة أخرى عند درجة حرارة أربع درجات مئوية بعد عملية الديالة.

يُغلى sample لمدة 30 دقيقة عند 57 °C في حمام مائي. ولتعطيل عوامل المتممة، يتم تحديد التركيز الكلي لـ IgG وتحضير أجزاء عليكوت تحتوي كل منها على 330 µg من IgG. في هذا الإجراء، يتم تحضير محلول عزل منظم خالٍ من الكالسيوم وفقاً للمخطوطة المرفقة.

بعد ذلك، املأ الخزان العلوي لنظام التروية (lanor perfusion system) ذو المنظم الحراري بـ 80 milliliters من IB، وحافظ على المحلول المنظم عند 37 degrees Celsius مع تهويته بـ 95%oxygen و5%carbon dioxide لمدة 30 دقيقة. أذب ما يقرب من 7,000 إلى 10,000 وحدة من collagenase type two و174 milligrams من BSA الخالي من الأحماض الدهنية في 20 milliliters من IB الذي يحتوي على 112.5 micromolar من calcium chloride، ثم اضبط pH محلول العزل في الخزان العلوي إذا لزم الأمر.

بعد ذلك، يتم تخدير جرذ من سلالة wistar بوزن يتراوح بين 175 إلى 200 grams باستخدام thiopental بجرعة 375 micrograms per kilogram مع إضافة 2, 500 IU من heparin إلى محلول thiopental. بعد إجراء عملية فتح الصدر، يتم استئصال القلب بعناية مع الحفاظ على قوس الأبهر سليمًا ونقله إلى محلول sodium chloride بتركيز zero point percent مبرد بالثلج. يتم بعد ذلك إزالة الدم والأنسجة المحيطة بالقلب.

ثم انقله إلى محلول كلوريد الصوديوم الطازج بتركيز 0.9% واكشف الشريان الأورطي. قم بتشغيل مخفض التدفق في نظام Langor للحصول على سرعة تنقيط تتراوح بين قطرتين إلى ثلاث قطرات في الثانية. بعد ذلك، قم بتوصيل القلب بالقنية.

قم بإجراء تروية له لمدة تصل إلى ثلاث دقائق بمعدل تدفق قدره قطرة واحدة في الثانية لغسل الدم المتبقي. بعد ذلك، قم بتدوير الـ IB في نظام LOR. الآن اسحب 20 milliliters من المحلول المنظم من الخزان العلوي.

املأ الخزان بمحلول الكولاجيناز وأضف قدراً كافياً من المنظم للوصول إلى 80 milliliters. بعد ذلك، قم بتدوير محلول الهضم لمدة 27 دقيقة إضافية. ثم افصل القلب عن الكانيولا.

قم بإزالة الأذينين والشريان الأبهر، ثم قطع البطينين إلى قطع صغيرة. اترك محلول الهضم يتدفق إلى الخزان السفلي. قلل الحجم إلى 40 milliliters كحد أقصى لمواصلة هضم قطع البطينين لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة تحت تهوية مستمرة بـ 95%oxygen و 5%carbon dioxide.

بعد ذلك، قم بترشيح معلق الخلايا عبر شاش بحجم مسام 200 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلتر. وأخيراً، استعد محتوى الكالسيوم في الخلايا عن طريق طرد مركزي لمعلق الخلايا بسرعة 40 3G لمدة دقيقتين. وفي درجة حرارة الغرفة، أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر.

يتم طرد مركزي للوسط IB المحتوي على 200 micromolar من كلوريد الكالسيوم مرة أخرى، ثم تُعلق الخلايا في 10 milliliters من الوسط IB المحتوي على 500 micromolar من كلوريد الكالسيوم. وبعد عملية طرد مركزي نهائية، يتم تعليق الخلايا القلبية في وسط EB مرشح ومعقم بكثافة 50,000 خلية لكل milliliter.

قم بطلاء شرائح التغطية في غرفة ذات أربعة آبار بـ 10 micrograms من اللامينين لكل بئر، وانتظر حتى تجف تماماً. ثم ضع ملليلتر واحد من معلق الخلايا العضلية القلبية في كل بئر. باستخدام ماصة دقيقة ذات طرف مقصوص، اترك الخلايا تلتصق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وقم بتخفيف 10 microliters من المحلول المخزون fira 2:00 AM بتركيز one milligram per milliliter في خمسة milliliters من الـ eb، واحفظ محلول التلوين في الظلام.

بعد ذلك، قم بإزالة المحلول المنظم والخلايا غير الملتصقة من شرائح التغطية، ثم أضف بواسطة الماصة 0.5 milliliters من محلول الصبغ. قم بحضن الخلايا في كل بئر لمدة 10 دقائق مع الرج المتوسط. لاحقاً، قم بإزالة محلول الصبغ واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 milliliter من eb.

ثم أضف 0.5 milliliters من EB إلى كل بئر في هذا الإجراء، وضع غطاء الزجاج تحت مجهر فلوري مقلوب متصل بنظام تسجيل كالسيوم وانقباض الخلايا العضلية القلبية. ضع قطبًا كهربائيًا مصنعًا خصيصًا مزودًا بأنبوب تدفق ودخول في البئر الأول وقم بغمر الخلايا العضلية القلبية بـ one milliliter per minute من eb.

ابدأ التحفيز الكهربائي عند 20 volts، وبتردد 1 hertz ومدة 5 milliseconds لكل نبضة، واترك الخلايا تتكيف مع التحفيز لمدة دقيقتين تقريبًا. اختر خلية عضلية قلبية سليمة عصوية الشكل ذات تخدد واضح وانقباض مستمر وقم بوضعها في مركز المجال البصري. بعد ذلك، افتح قناة الكاميرا ووجّه الخلية أفقيًا ضمن منطقة الفيديو عن طريق تدوير محول تأطير الخلايا وتحريك منصة المجهر.

قم بضبط حدود عناصر التحكم في الكشف لمنطقة الفيديو. قم بتشغيل القناة الفلورية وسجل من 10 إلى 15 انقباضًا للحصول على القصر الأولي للخلية والعابر الكلسي. بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل قناة ضوء المجهر لتجنب بهتان الصبغة الفلورية.

قم بتحويل التدفق من محلول EB إلى مسار تجاوز العينة باستخدام صمام ثلاثي الاتجاهات، ثم قم بتعطير الخلايا العضلية القلبية بـ 1 mL من IgG الخاص بالمريض. أوقف المضخة قبل وصول الهواء مباشرة إلى البئر، ثم قم بتشغيل القناة الضوئية وسجل من 10 إلى 15 انقباضًا إضافيًا للحصول على الاستجابة الخلوية الحادة. بعد ذلك، أوقف التسجيل وأغلق القناة الضوئية مرة أخرى، وكرر التسجيلات بعد دقيقتين وخمس دقائق، ثم اسحب القطب الكهربائي من البئر عند الانتهاء. وفي النهاية، قم بتحليل تقصر الخلايا والعابر الكلسي باستخدام برنامج ion wizard، وذلك باستخدام نافذة edge length/length وURA two numeric subtracted/ratio على التوالي.

بعد ذلك، احسب النسب المئوية للتغيرات في الاستجابات الحادة، واستجابة الدقيقتين، واستجابة الخمس دقائق، وذلك مقارنةً بالتقصير الأولي للخلية وبالارتفاع الذروي للعابر الكلسي. إليك مثالاً تمثيلياً لقياس العينة الضابطة. تمت مراقبة تقصير الخلية والعابر الكلسي مباشرةً قبل الإرواء الفائق بـ IgG، وفوراً بعد دقيقتين وخمس دقائق من الإرواء الفائق بـ IgG.

وفيما يلي مثال على قياس عينة IgG تحتوي على أجسام مضادة مثبطة لعضلة القلب. تم قياس تقصر الخلية والعابر الكالسيومي عبر الإنترنت قبل الإرواء الفوقي بـ IgG، وفوراً بعد دقيقتين وخمس دقائق من الإرواء الفوقي بـ IgG. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك رؤية جيدة حول كيفية الكشف عن الأجسام المضادة المرورية القلبية في بلازما المريض من خلال قياس تأثير IgG المعزول على تقصر الخلية والعابر الكالسيومي في خلايا عضلة القلب البالغة المعزولة.