قياس تأثيرات على الأجسام المضادة من وظيفة الخلوية Cardiomyocytes متفرقة

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن الأجسام المضادة للقلب الاستوائي في بلازما المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب التوسعي أو أمراض القلب الأخرى ذات الخلفية المناعية الذاتية. يتم تحقيق ذلك من خلال امتصاص مناعي مصغر أولي لبلازما المريض على أعمدة الأفير المضادة ل IgG لتنقية الغلوبولين المناعي G كخطوة ثانية. يتم عزل خلايا عضلة القلب البطينية من فئران الويستار البالغة التي توفر القاعدة الخلوية لهذا الاختبار الحيوي.

بعد ذلك ، يسمح لخلايا عضلة القلب بالالتصاق بزلات غطاء الغرفة وتلطيخها ب URA 2:00 صباحا من أجل تمكين ملاحظة الكالسيوم العابر داخل الخلايا أثناء الانقباضات ، ثم يتم اختبار IgG للمريض لمراقبة تأثيره على انقباض خلايا عضلة القلب. توضح النتائج ما إذا كان IgG للمريض يحتوي على أجسام مضادة استوائية بناء على التغيرات في الانقباض والكالسيوم العابر في خلايا عضلة القلب المعزولة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل المقايسات المناعية القياسية للكشف عن الأجسام المضادة هي أنها مستقلة عن مستضد معين وأنها تسمح بالتمييز بين تحفيز الأجسام المضادة وحظرها.

عرض الإجراء سوف bera جوجل وتجربة المساعدة الفنية من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد أعمدة الامتصاص المناعي المصغرة عن طريق ملء ثلاثة ملليلتر ، الأسفار المضادة ل IgG لكل ملليلتر من بلازما EDTA للمريض في عمود اقتصادي فارغ. بعد ذلك ، ضع مرشحا فوق الأفير المضادة ل IgG.

اقطع الطرف السفلي للعمود واضغط على الفلتر للوصول إلى معدل تدفق يبلغ قطرة واحدة تقريبا في الثانية. ثم اغسل العمود ثلاث مرات بحجم بلازما واحد يبلغ 0.9٪ ماصة كلوريد الصوديوم البلازما في العمود عندما تكون البلازما مغمورة تماما في غسل الأفطر المضاد ل IgG بنفس الحجم 0.9٪ كلوريد الصوديوم. بعد ذلك ، قم بتقطيع حجم بلازما واحد يبلغ 0.2 مولار جلايسين هيدروكلوريد عند درجة الحموضة 2.8 في العمود واتركه يغمر في الفوس.

ثم أضف حجما آخر من هيدروكلوريد الجلايسين إلى العمود. اجمع التدفق في أنبوب سعة 15 مليلتر واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 باستخدام 0.5 مولار تريس هيدروكلوريد عند p pH 8.0 لتجديد العمود. اغسلها بثلاثة أحجام بلازما من هيدروكلوريد الجلايسين بعد غسلها النهائي بمجلدين من 0.9٪ كلوريد الصوديوم.

يمكن استخدام العمود لعينة البلازما التالية لاستخدامها في خلايا عضلة القلب. يجب تحليل جزء IgG الذي تم جمعه ضد المخزن المؤقت التجريبي عن طريق ملء جزء IgG أولا إلى أنبوب غشاء غسيل الكلى إستر السليلوز مع قطع الوزن الجزيئي عند 100 كيلودالتون. ثم ضع الأنبوب في لتر واحد EB وحركه ببطء مع تحريك مغناطيسي عند أربع درجات مئوية بعد ثماني ساعات ، انقل أنبوب غسيل الكلى إلى ثلاثة لترات من EB الطازج وغسيل الكلى لمدة 20 ساعة أخرى عند أربع درجات مئوية بعد غسيل الكلى.

اغلي العينة لمدة 30 دقيقة عند 57 درجة مئوية في حمام مائي. لتعطيل العوامل التكميلية ، حدد إجمالي تركيز IgG وقم بإعداد حصص مع احتواء كل منها على 330 ميكروغرام من IgG. في هذا الإجراء ، قم بإعداد عازل عازل خال من الكالسيوم وفقا للمخطوطة المصاحبة.

ثم املأ 80 مل من IB في الخزان العلوي لنظام تروية اللان بالحرارة وحافظ على المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية وقم بتهويته بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. قم بإذابة ما يقرب من 7 ، 000 إلى 10 ، 000 وحدة من الكولاجيناز من النوع الثاني و 174 ملليغرام من BSA الخالي من الأحماض الدهنية في 20 ملليلترا. IB يحتوي على 112.5 ميكرومولار كلوريد الكالسيوم وضبط الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت للعزل في الخزان العلوي إذا لزم الأمر.

بعد ذلك ، قم بتخدير فأر الويستار من 175 إلى 200 جرام باستخدام ثيوبنتال بمعدل 375 ميكروغرام لكل كيلوغرام مع إضافة 2،500 وحدة دولية من الهيبارين إلى محلول ثيوبنتال. بعد بضع الصدر ، استئصال القلب بعناية باستخدام قوس أورطي سليم ونقله إلى كلوريد الصوديوم المثلج ، صفر نقطة في المائة كلوريد الصوديوم في كلوريد الصوديوم المثلج. إزالة الدم والأنسجة المحيطة به من القلب.

ثم انقله إلى 0.9٪ كلوريد الصوديوم الطازج وكشف الشريان الأورطي. قم بتشغيل مخفض التدفق لنظام لانجور للحصول على سرعة إسقاط من اثنين إلى ثلاثة في الثانية. ثم نعلق القلب على قنية.

قم بتثبيته لمدة تصل إلى ثلاث دقائق بمعدل تدفق قطرة واحدة في الثانية لغسل الدم المتبقي. بعد ذلك ، قم بتعميم الوسيط المعرف في نظام LOR. الآن قم بإزالة 20 مل من المخزن المؤقت من الخزان العلوي.

املأ الخزان بمحلول الكولاجيناز وأعد ملء أكبر قدر ممكن من العازلة لتصل إلى 80 ملليلترا. ثم قم بتعميم محلول الهضم لمدة 27 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، افصل القلب عن القنية.

قم بإزالة الأذينين والشريان الأورطي ، ثم اقطع البطينين إلى قطع صغيرة. اسمح للمخزن المؤقت للهضم بالدخول إلى الخزان السفلي. قلل الحجم إلى 40 مل كحد أقصى لهضم البطينين المفروم لمدة 10 إلى 15 دقيقة تحت التهوية المستمرة مع 95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شاش بحجم شبكة 200 ميكرون في أنبوب سعة 50 مل. أخيرا ، قم باستعادة محتوى الكالسيوم في الخلايا عن طريق الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 40 3G لمدة دقيقتين. في درجة حرارة الغرفة ، أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر.

IB يحتوي على 200 جهاز طرد مركزي من كلوريد الكالسيوم ميكرومولار مرة أخرى وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر. IB مع 500 ميكرومولار كلوريد الكالسيوم. بعد الطرد المركزي النهائي ، قم بتعليق خلايا عضلة القلب في EB مفلتر معقم بكثافة 50 ، 000 خلية لكل مليلتر.

قم بتغطية أكواب الغطاء في حجرة من أربعة آبار ب 10 ميكروغرام من اللامينين لكل بئر ، وانتظر حتى يجف تماما. ثم املأ ملليلترا واحدا من تعليق عضلة القلب في كل بئر. باستخدام ماصة صغيرة ذات طرف مقطوع والسماح للخلايا بالالتصاق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل مليلتر من محلول مخزون 2:00 صباحا في خمسة ملليلتر ، eb ، واحتفظ بمحلول التلوين في الظلام.

بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت والخلايا غير المتصلة من ماصة زجاج الغطاء 0.5 مل من محلول التلوين. في كل منها ، احتضان الخلايا جيدا لمدة 10 دقائق تحت اهتزاز معتدل. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول التلوين وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مليلتر واحد eb.

ثم أضف 0.5 مل EB إلى كل بئر في هذا الإجراء ، ضع زجاج الغطاء تحت مجهر مضان عكسي متصل بنظام تسجيل الكالسيوم والانقباض للخلايا العضلية. ضع قطبا كهربائيا مخصصا مع أنبوب تدفق وتدفق في البئر الأول والفائق. دمج خلايا عضلة القلب مع ملليلتر واحد في الدقيقة eb.

ابدأ التحفيز الكهربائي عند 20 فولت ، ومدة هرتز واحدة وخمس مللي ثانية لكل نبضة ، واسمح للخلايا بالتكيف مع التحفيز لمدة دقيقتين تقريبا. اختر خلية عضلة قلبية سليمة على شكل قضيب مع تشقق واضح وتقلص مستمر وضعها في وسط المجال البصري. ثم افتح قناة الكاميرا وقم بتوجيه الخلية أفقيا داخل منطقة الفيديو عن طريق تدوير محول إطار الخلية ، وتحريك مرحلة المجهر.

اضبط حدود عناصر التحكم في الكشف عن منطقة الفيديو. قم بتشغيل قناة الفلورسنت وسجل من 10 إلى 15 انقباضا للحصول على تقصير الخلية الأولي وعابر الكالسيوم. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل قناة ضوء المجهر لتجنب تبييض بقعة الفلورسنت.

قم بتبديل التدفق من EB إلى مجازة العينة باستخدام صمام ثلاثي الاتجاهات ودمج خلايا عضلة القلب مع ملليلتر واحد من IgG للمريض. أوقف المضخة قبل وصول الهواء مباشرة ، قم بتشغيل قناة الضوء وسجل 10 إلى 15 تقلصا أخرى للحصول على استجابة الخلية الحادة. ثم أوقف التسجيل مؤقتا وقم بإيقاف تشغيل قناة الضوء مرة أخرى ، وكرر التسجيلات بعد دقيقتين وخمس دقائق واسحب القطب من البئر عند الانتهاء في النهاية ، وقم بتحليل تقصير الخلية وعابر الكالسيوم باستخدام برنامج معالج الأيونات باستخدام طول الحافة المائلة ونافذة نسبة الشرطة المائلة المطروحة الرقمية URA على التوالي.

بعد ذلك ، احسب النسبة المئوية للتغيرات للاستجابات الحادة والدقيقتين والخمس دقائق من تقصير الخلية الأولي وارتفاع الذروة العابر للكالسيوم. فيما يلي مثال تمثيلي لقياس التحكم. تمت مراقبة تقصير الخلايا وعبور الكالسيوم عبر الإنترنت قبل التصهار الفائق باستخدام IgG وعلى الفور بعد دقيقتين وخمس دقائق من التروجين باستخدام IgG.

وهنا مثال على قياس عينة IgG تحتوي على أجسام مضادة للاكتئاب القلبي. تم قياس تقصير الخلايا وعابر الكالسيوم عبر الإنترنت قبل الاندماج الفائق باستخدام IgG ومباشرة بعد دقيقتين وخمس دقائق من التروجين باستخدام IgG. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف الأجسام المضادة لحركة القلب في بلازما المريض عن طريق قياس تأثير IgG المعزول على تقصير الخلايا في الكالسيوم العابر لخلايا عضلة القلب الحمراء المعزولة للبالغين.