الجهد حساسة من تسجيل صبغ محاور عصبية، التشعبات والعمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الفردية في شرائح الدماغ

الهدف العام من التجارب الموصوفة هو مراقبة تكامل إشارة الغشاء المحتملة ومعالجة المعلومات بواسطة خلية عصبية فردية بصريا بدقة دون ميكرومتر وأقل من المللي ثانية من مواقع متعددة على الخلايا العصبية. يتم تحقيق ذلك من خلال بناء إعداد تصوير أولا بحساسية مناسبة للسماح بتسجيل التغيرات الجزئية الصغيرة في شدة الضوء المقابلة لإمكانات الغشاء العابرة. بعد ذلك ، حدد الخلايا العصبية ذات التشريح المناسب للتصوير الفعال للخلايا العصبية ذات العمليات الطويلة السليمة في مستوى بؤري واحد بالقرب من سطح الشريحة.

ثم قم بتحميل الخلايا العصبية المحددة مسبقا بأصباغ حساسة للجهد للسماح بالتتبع البصري للتغيرات المحتملة للغشاء. تظهر النتائج القدرة الفريدة لهذا النهج على الحصول على معلومات حول تكامل الإشارات الكهربائية بواسطة الخلايا العصبية الفردية من خلال مراقبة إشارات الغشاء المحتملة من المحاور والتشعبات والعمود الفقري المتغصن. في الفيزيولوجيا العصبية الخلوية.

يتم تطوير أدوات جديدة بسبب القيودين الطويلة الأمد للفيزيولوجيا الكهربية التقليدية ، والدقة المكانية المنخفضة لقياسات القطب الكهربائي ، وعدم القدرة على التسجيل من الهياكل الصغيرة مثل الضمانات المحورية أو العمود الفقري المتغصن. للتغلب على هذه العيوب ، يمكن دمج نهج قطب التصحيح مع التقنيات البصرية التي تسمح بتسجيلات متوازية من جميع أجزاء الجهاز العصبي. نصف هنا مثل هذه التقنية ، التسجيل البصري متعدد الجوانب للعابرين المحتملين للغشاء بدقة العمود الفقري الفردي.

في هذه التجربة ، يتم استخدام مجهر عمودي وثلاث كاميرات لضبط الإضاءة الموحدة. أولا ، أدخل مرشح كثافة محايدة مناسب في مسار شعاع الليزر. بعد ذلك ، ركز الهدف على سطح شريحة الفلورسنت القياسية.

أثناء مراقبة صورة CCD لمجال الرؤية على شاشة الشاشة ، اضبط موضع الطرف المستقبل لدليل ضوء الكوارتز وموضع نهاية الإخراج لدليل الضوء باستخدام مشغلات مناسبة على مكثف مضان epi من أجل تحقيق إضاءة مركزية وموحدة لمجال الرؤية. لتحديد الضوضاء الاهتزازية ، استخدم شريحة فلورسنت قياسية مع علامة غير فلورية على السطح. سجل شدة الضوء باستخدام CCD العصبي في الوضع المستمر.

ركز الهدف على حافة داكنة من العلامة السوداء ، وسجل شدة الضوء لحوالي 100 مللي ثانية بمعدل إطارات كيلو هرتز. ثم اعرض المتوسط المكاني لآثار شدة الضوء الجزئي من حوالي 20 بكسل تستقبل الضوء من المنطقة المضاءة بشكل موحد ومن حوالي 20 بكسل على طول حافة العلامة السوداء. تعكس الضوضاء الزائدة في المتوسط المكاني من وحدات البكسل ذات الحواف عالية التباين الضوضاء الاهتزازية في النظام.

من الضروري تركيب الغالق الميكانيكي على طاولة عزل الاهتزاز حتى لا يؤدي فتح الغالق إلى حدوث ضوضاء اهتزازية في التسجيل البصري. هذه خطوة حاسمة. قم بتركيب الغالق باستخدام مسامير بلاستيكية ومواد عزل الاهتزاز لتقليل الضوضاء الاهتزازية الصوتية التي يمكن أن يلتقطها نظام التسجيل البصري.

لعزل الاهتزاز، اضبط جدول عزل الاهتزاز حتى تصبح ضوضاء الاهتزاز لوحدات البكسل التي تغطي الحافة الحادة للصورة أصغر من ضوضاء اللقطة. يجب أن تكون أسلاك المعدات الموجودة على الطاولة فضفاضة لتجنب نقل الاهتزازات الميكانيكية إلى المجهر. في هذا الإجراء ، قم بإعداد شرائح الدماغ بسماكة 300 إلى 400 ميكرون وفقا للإجراءات القياسية باستخدام خط فأر يعبر عن EGFP في الخلايا العصبية الفردية ذات الأهمية مع نظام متحد البؤر للقرص الدوار.

تصور الخلايا العصبية المسماة EGFP في الشريحة. بعد ذلك ، حدد الخلايا العصبية ذات الأشجار المحورية الشجيرية السليمة ، ومع العمليات التي تعمل بالتوازي وبالقرب من سطح الشريحة لتصوير إمكانات الغشاء. ثم املأ ماصة زجاجية من الطرف بمحلول داخل الخلايا خال من الصبغة يصل إلى ثلثي تفتق القطب الكهربائي عن طريق الضغط السلبي لمدة 15 ثانية تقريبا.

بعد ذلك ، قم بملء القطب الكهربائي بالمحلول الذي يحتوي على صبغة حساسة للجهد IMP تتخلل الغشاء المذابة في المحلول داخل الخلايا. الآن ، قم بتصحيح خلية عصبية تم اختيارها مسبقا في غضون دقيقة واحدة من تحميل الصبغة في القطب. استخدم ضغطا موجبا منخفضا حوالي 10 ملليمترات من الزئبق قبل إنزال الماصة في الحمام، وأثناء وضع القطب الكهربائي في الشريحة، يضمن ذلك عدم تسرب الصبغة من القطب الكهربائي قبل إنشاء مانع التستم.

قم بزيادة الضغط العالي حوالي 100 ملم من الزئبق قبل أن يلامس القطب سطح الخلية مباشرة. عند تثبيت الختم في تكوين الخلية بأكملها ، يسمح بالانتشار الحر للصبغة من ماصة التصحيح الجسدية إلى سوما لمدة 20 إلى 45 دقيقة. أثناء الانتشار المصبوغ ، راقب الحالة الفسيولوجية للخلايا العصبية عن طريق تسجيل إمكانات العمل المستحثة في وضع المشبك الحالي.

بالإضافة إلى ذلك ، راقب مقدار التلوين عن طريق تسجيل شدة الضوء المريح من سوما الخلية بمعدل إطارات يبلغ كيلوهرتز وبجزء بسيط من شدة الضوء الكاملة المعدلة باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة. استمر في عملية التنزيل حتى تبدأ إمكانية الإجراء في التوسع. في نهاية التلوين، اسحب ماصة التصحيح بعناية بعيدا عن سوما في تكوين مشبك الجهد لضمان تحقيق الانتقال من الخلية بأكملها إلى تكوين التصحيح الخارجي في هذه العملية.

ثم يحتضن S الشريحة لمدة 1.5 إلى ساعتين إضافيتين في درجة حرارة الغرفة للسماح للصبغة الحساسة للجهد بالانتشار في العمليات العصبية. بعد انتشار كمية كبيرة من الصبغة بعيدا عن سوما إلى العمليات المتغصنة والمحورية ، يجب استعادة الشكل الموجي لجهد الفعل بالكامل. في الخطوة التالية ، حدد موقع سوما الخلايا العصبية للبقع تحت التألق منخفض الكثافة.

قلل شدة الضوء باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة إلى الحد الأدنى المطلوب لتصور الكائن محل الاهتمام باستخدام مرحلة XY امسح منطقة الشريحة التي تحتوي على الخلايا العصبية الفلورية حتى يتم تحديد سوما الفلورسنت. ضع سوما الخلية الملطخة في وسط ممثل مجال المجهر ، وقم بضرب الخلايا العصبية باستخدام قطب رقعة قياسي بدون صبغة تحت DIC. ثم تصور العمليات العصبية تحت التألق منخفض الكثافة بمعدل إطارات من 10 إلى 40 هرتز في وضع التسجيل المستمر ل CCD لتصوير الجهد.

باستخدام موضع مرحلة XY ، فإن العملية العصبية ذات الأهمية في منتصف منطقة التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، قم بحماية SOMA من ضوء الإثارة باستخدام قزحية إيقاف المجال المغلقة جزئيا في المجهر لتقليل الضرر الضوئي الديناميكي. بعد ذلك ، قم بتسجيل الإشارات الضوئية المتعلقة بإمكانات عمل الانتشار الخلفي في الفروع المتغصنة الفردية.

ثم سجل الإشارات الضوئية المتعلقة بإمكانيات الفعل في المحور العصبي. بعد ذلك ، قم بتسجيل الإشارات الضوئية المتعلقة بإمكانات عمل الانتشار الخلفي في العمود الفقري المتغصن. استخدم معدل الإطارات المناسب لإعادة بناء شكل موجة الإشارة بدقة.

في الوقت نفسه ، حافظ على فترات التسجيل والتعرض لضوء الإثارة عالي الكثافة قصيرا قدر الإمكان من أجل تقليل تبييض الصبغة والضرر الضوئي الديناميكي. يظهر تسجيل الإشارات الضوئية هنا. هنا. تظهر اللوحة العلوية صورة متحد البؤر عالية الدقة لخلية عصبية ملطخة مع محورها العصبي في موضع التسجيل.

بينما تعرض اللوحة الوسطى صورة مضان ذات دقة مكانية منخفضة للمحور العصبي الذي تم الحصول عليه بواسطة CCD المستخدم في تصوير إمكانات الغشاء ، تعرض اللوحة السفلية تسجيلات القطب الكهربائي من soma والتسجيلات البصرية من A IS وعقدة rvi. يتم عرض البيانات الأولية والإشارات المعالجة. يوضح هذا الشكل إشارات جهد الفعل من محور عصبي L five قشري محمل بعمل صبغة حساس للجهد.

تم تسجيل الإشارات ذات الصلة المحتملة بمعدل إطارات قدره 10 كيلو هرتز. تشير هذه الآثار إلى جهد الفعل العابر من ثلاثة مواقع. أحدهما ، تسجيل القطب الكهربائي من سوما.

اثنان ، التسجيلات البصرية من التل المحوري ، وثلاثة ، التسجيل البصري من النوتة الأولى من vie ، وهنا الإشارات المتراكبة من نفس المواقع الثلاثة. يوضح هذا الشكل انفجارا لأربع إشارات محتملة للفعل تنتشر مرة أخرى من مواقع متعددة على الشجرة الشجيرية لخلية عصبية قشرية L خمسة تبدأ بواسطة نبضات تيار قصيرة لإزالة الاستقطاب عند 100 هرتز. تظهر هنا إشارات جهد الفعل من العمود الفقري الشجيري الفردي.

فيما يلي إعادة البناء التشريحية التي تم الحصول عليها من كومة من الصور متحدة البؤر للقرص الدوار ، وها هي الصورة المضان لنفس المنطقة التي تم الحصول عليها باستخدام كاميرا CCD. بالنسبة لتصوير إمكانات الغشاء ، تظهر آثار شدة التألق المقابلة لجهد الانتشار الخلفي من المواقع من واحد إلى ثلاثة كما هو موضح في صورة CCD في اللوحة اليمنى. يشير التتبع السفلي إلى تسجيل القطب الكهربائي من السوما.

يستغرق إعداد التسجيل المسبق حوالي ثلاث ساعات ، بما في ذلك فترة الانتظار حتى ينتشر النرد إلى العمليات البعيدة. وقت التسجيل محدود بالتهدئة العادية للتحضير والضرر الضوئي الديناميكي للفوائد. يتناسب مقدار الضرر الضوئي الديناميكي مع شدة ضوء الإثارة ، ومدة وعدد تجارب التسجيل الفردية.

في بعض التجارب ، من الممكن إجراء أكثر من 50 تجربة تسجيل على مدار ساعة أو ساعتين. تتطلب القياسات الأخرى إثارة عالية ، وشدة ضوئية ، وتسجيلات أطول ، وهي محدودة بالضرر الضوئي الديناميكي لعدة تجارب تسجيل فقط. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تصوير الجهد من الهيكل المحوري والنهاية بالكامل للخلايا العصبية الفردية في شرائح الدماغ.