استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس نشاط قنوات البوتاسيوم KV seven في خلايا العضلات الملساء للشرايين المساريقية المفككة حديثاً، وربط ذلك بقياسات قطر الشرايين المسجلة تحت الظروف الفسيولوجية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة القوس الوعائي المساريقي جراحياً من جرذ. وتتمثل الخطوة الثانية في تشريح وتنظيف أجزاء من الشرايين المساريقية.

بعد ذلك، تُستخدم بعض القطع لعزل خلايا العضلات الملساء الفردية لإجراء قياسات كهروفسيولوجية باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) لتيارات البوتاسيوم KV seven. وتتمثل الخطوة النهائية في قسطرة قطع شريانية سليمة لقياسات ضغط العضلات (pressure myo) لتقييم تضيق الشرايين أو توسعها استجابةً للمعدلات الدوائية لقنوات البوتاسيوم KV seven. وفي الختام، يُستخدم الجمع بين الكهروفسيولوجيا بتقنية تثبيت الرقعة وقياس ضغط العضلات لتوضيح كيف يؤثر زيادة أو نقصان نشاط قنوات البوتاسيوم KV seven على تضيق الشرايين المساريقية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام القنوات المستنسخة التي يتم التعبير عنها في الخطوط الخلوية، في أن التيارات يتم تسجيلها من خلايا غير مستزرعة تعبر عن القنوات بشكل طبيعي، كما يمكن عزل تيارات KV عن الفئات الأخرى من قنوات البوتاسيوم التي قد يتم تنشيطها في الخلايا نفسها. ويسمح قياس تقلص العضلات بالضغط (pressure myography) بتسجيل الاستجابات الوظيفية من نفس النسيج الذي اشتقت منه الخلايا المعزولة، وتعد هذه الطريقة أكثر حساسية وأكثر محاكاة للوظائف الفسيولوجية من التحضيرات الأخرى مثل الحلقات الشريانية أو الشرائح الشريانية. سيقوم الدكتور Bareth Mani، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح تقنيات القسطرة الشريانية وقياس تقلص العضلات بالضغط، بينما ستقوم الدكتورة Luba Brueggeman، الأستاذ المساعد للأبحاث في مختبري، بشرح إجراءات عزل الخلايا وتثبيت الرقعة (patch clamp).

لبدء هذا الإجراء، استخدم مقصاً جراحياً لقص قطعة بطول 10 إلى 12 سنتيمتر من كلا طرفي الأمعاء الدقيقة للفأر. ثم اعزل الأمعاء مع الأوعية الدموية المتصلة بها. بعد ذلك، قم بتثبيت قطعة الأمعاء الدقيقة باستخدام دبابيس.

قم بفرد المساريقا على الجانب القريب من الغرفة بحيث يكون الفرع الرئيسي للشريان المساريقي العلوي في المركز، وتشع منه الفروع التالية بالترتيب من المركز. ثم ضع الدبابيس فقط على القطع المعوية أثناء الرؤية من خلال مجهر تشريح مضيء. قم بإزالة الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة المحيطة بالشرايين من الرتبة الثانية إلى الرابعة القريبة من الأمعاء بعناية باستخدام ملاقط ومقصات دقيقة.

ثبّت الأوردة المجاورة لتسهيل إزالة النسيج الدهني والنسيج الضام وتجنب التمدد غير الضروري للشرايين. الآن، انقل قطعتين إلى ثلاث قطع من الشريان المساريقي إلى طبق زراعة أنسجة بحجم 35 مليمتر يحتوي على 2 مل من محلول العزل البارد جداً. ضع الطبق على الثلج بعد ذلك، وقطّع قطع الشريان المساريقي إلى قطع بطول 3 إلى 4 مليمتر باستخدام ماصة PEs ذات طرف مصقول بالنار.

انقل القطع الشريانية إلى قارورة زجاجية تحتوي على 2 mL من محلول العزل المسخن مسبقاً إلى 37 °C. ثم قم بحضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. بعد مرور 30 دقيقة، اسحب محلول العزل عند 37 °C بعناية باستخدام ماصة باستور.

أضف مليليترين من محلول الإنزيم الدافئ إليه، ثم حضنه لمدة 35 دقيقة عند 37 درجة مئوية. فور انتهاء فترة التحضين التي استمرت 35 دقيقة في محلول الإنزيم، ضع الأنبوب على الثلج، واشفط محلول الإنزيم وأضف مليليترين من محلول العزل المبرد بالثلج. كرر هذه العملية أربع مرات.

بعد ذلك، وفي واحد مليلتر من محلول العزل المبرد بالثلج، قم بإجراء عملية تكرارية لطيفة لقطع الشرايين باستخدام ماصة خلفية مصقولة من 10 إلى 20 مرة لتحرير خلايا العضلات الملساء الفردية للشريان المساريقي. تحقق من مظهر الخلايا العضلية بشكل دوري عن طريق وضع قطرة من معلق الخلايا على طبق قطر 35 مليمتر وفحصها تحت المجهر.

يجب أن تظهر خلايا العضلات الملساء في الشريان الأورطي للفأر (MA SMCs) السليمة بمظهر متطاول وأملس. بعد ذلك، انقل ما يقرب من 100 إلى 200 µL من معلق الخلايا إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة باستير مصقولة، واترك الخلايا تلتصق لمدة 15 دقيقة. في هذه الخطوة، املأ طرف ماصة الرقعة (patch pipette) بمحلول داخلي خالي من amphotericin B، وذلك عن طريق غمس طرف الماصة فيه.

ثم قم بتطبيق الشفط على الطرف الآخر باستخدام سرنجة سعة 10 milliliter متصلة عبر قطعة أنبوب، وأضف محلول الماصة من الأعلى. استخدم طرف ماصة einor micro loader حتى تمتلئ الماصة بالمحلول إلى منتصفها تقريبًا. قم بإزالة أي فقاعات هوائية عن طريق النقر برفق على الماصة.

بعد ذلك، أدخل الماصة في حامل القطب الكهربائي. استخدم جهاز تحريك دقيق (micro manipulator) لخفض الماصة حتى تصل إلى سطح خلية عضلية قلبية مستطيلة. وعندما تزداد مقاومة الماصة لتصل إلى ما بين 6 إلى 10 mega ohms، قم بتطبيق الشفط لتحقيق سدادة جيجا (giga seal).

في الوقت نفسه، اضبط جهد التثبيت على صفر millivolts أثناء انتظار ثقب الغشاء. بعد ذلك، قم بتطبيق خطوات جهد لمدة 100 millisecond إلى +10 millivolts ثم إلى -10 millivolts. استخدم المضخم لتعويض العابر السريع لسعة الماصة بالتزامن مع ظهور سعة الخلية الكاملة.

تشير التيارات الموجبة المستمرة الصغيرة والعابرة التي تتراوح قيمتها بين 2 إلى 10 pA من حيث النقاء والسعة إلى وجود قنوات KV7 وظيفية. ويؤدي الثقب الناجح باستخدام amphotericin B إلى تقليل مقاومة الوصول إلى 35 MΩ أو أقل. ولتسجيل العلاقة بين الجهد والتيار لقنوات KV7، يتم تطبيق خطوات جهد لمدة خمس ثوانٍ بجهود تتراوح من -84 mV، حيث تكون احتمالية فتح قنوات KV7 في حدها الأدنى، إلى +16 mV، حيث تصل احتمالية فتح قنوات KV7 إلى مرحلة الاستقرار. وبعد خمس ثوانٍ عند كل جهد اختبار، يتم الرجوع إلى جهد الحفظ عند -4 mV لمدة 10 ثوانٍ.

في هذا الإجراء، يتم تعليق خيطين من خيوط النايلون الدقيقة الجاهزة بشكل فضفاض على كل جانب. وبجوار الكانيولا الزجاجية، يتم نقل قطعة الشريان المساريقي المشرح بعناية من غرفة التشريح إلى غرفة تطعيم العضلات تحت الضغط عن طريق إمساك أحد طرفي القطعة باستخدام ملقط دقيق. بعد ذلك، ومن خلال الرؤية عبر مجهر تشريح مضاء، يتم إمساك أحد طرفي قطعة الشريان وتمريرها برفق فوق الكانيولا الزجاجية اليسرى.

قم بتثبيت الطرف باستخدام غرز النايلون. ثم اشطف تجويف الوعاء الدموي المثبت برفق بتمرير السائل لإزالة الدم والحطام. بعد ذلك، يجب إغلاق الصمام المتصل بالحقنة اليسرى بحيث يمثل هذا الجانب عموداً ساكناً من السائل يتم ضبط الضغط مقابله من الجانب الأيمن، وباستخدام أداة التحكم الدقيق (micro manipulator)، ضع القنية الزجاجية اليمنى المتحركة في وضع أقرب إلى قطعة الشريان ثم اسحب الطرف الأيمن من القطعة فوقها.

أخيراً، قم بتثبيت قطعة الشريان باستخدام غرز النايلون وقص خيوط الغرز الزائدة. الآن، قم بتركيب وحدة الرسم البياني للضغط على المنصة فوق مجهر الصور المجهرية للضغط. صِل عمود الضغط بالجانب الأيمن من غرفة الرسم البياني، ثم ضع الغطاء فوق الغرفة.

ارفع حقنة الـ 10 milliliter تدريجياً على مدار 15 دقيقة، وافحص الوعاء بحثاً عن أي تسريبات حتى يقرأ محول ضغط P one قيمة 80 millimeters mercury. اضبط المسافة بين الكانولا عند الضرورة، بحيث يتم ضبط المسافة بطريقة تجعل قطعة الشريان المضغوطة مستقيمة تقريباً وتشكل نمطاً يشبه الكتف عند نقاط الربط. تحقق من حيوية الوعاء المثبت عن طريق التروية السطحية العابرة بـ 60 millimolar من كلوريد البوتاسيوم لمدة 30 ثانية. ينقبض الوعاء الحي بسرعة عند إضافة كلوريد البوتاسيوم ويتمدد فور غسله.

بعد ذلك، أضف المادة المختبرة المركزة إلى محلول الحمام، وقم بسحبها ودفعه مباشرة باستخدام الماصة بلطف بالقرب من نهاية الغرفة لخلط المادة المختبرة في محلول الحمام، مما ينتج عنه التركيز النهائي المناسب في الغرفة ذات سعة 10 milliliter. يمكن مراقبة التغيرات في الحجم في قطر الوعاء بعد إضافة المادة المختبرة من خلال صورة الفيديو المباشرة، وأيضاً تمثيلها بيانياً في نافذة تحليل الصور أثناء سير التجربة. يوضح هذا الشكل مجموعة من آثار التيار المتتالية المسجلة استجابة لخطوات الجهد قبل المعالجة كما هو موضح باللون الأسود، وبعد الاستقرار في وجود 100 nanomolar zinc perion في خلية عضلية واحدة من شريان مساريقي كما هو موضح باللون الأحمر؛ وهنا تظهر التيارات الممثلة للمجموعة الضابطة ولـ 100 nanomolar zinc perion.

تشير الأشرطة الرمادية إلى الفاصل الزمني الذي تم خلاله قياس متوسطات سعة التيار. وبالنسبة لمخططات التيار والجهد، تظهر قيم الجهد المرحلي على اليمين بواسطة رؤوس الأسهم. هذا هو المسار الزمني لتعزيز تيار KV7 بواسطة 100 nanomolar من zinc perion، مقاساً باستخدام تثبيت الجهد المستمر عند -20 millivolts. تظهر هنا منحنيات التيار والجهد المتوسطة المشتقة من كثافات تيار KV7 المسجلة قبل وأثناء المعالجة بـ 100 nanomolar من zinc perion، وأثناء المعالجة بـ 10 micromolar من مانع قناة KV7 المسمى XC 9 9 1، مما أدى إلى ارتخاء ناتج عن أيونات الزنك في الشريان المساريقي الذي تم تضييقه مسبقاً بـ 100 picomolar من arginine vasopressin.

يوضح هذا الشكل المجرى الزمني للتغيرات في القطر الخارجي للوعاء الدموي استجابةً لتطبيق 100 picomolar من arginine vasopressin، يليه تطبيق 100 nanomolar من أيون الزنك. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الشرايين لعزل الخلايا المفردة أو لقياس استجابات التضيق والتوسع الشرياني باستخدام قياس الميوجراف بالضغط. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تعرف كيفية تسجيل تيارات KV seven بمعزل عن التيارات الأخرى في الخلايا العضلية الشريانية المعزولة حديثاً.