استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس نشاط KV سبع قنوات بوتاسيوم في خلايا العضلات الملساء للشريان المساريقي المنفصلة حديثا ، وربطها بقياسات قطر الشرايين المسجلة في ظل الظروف الفسيولوجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الممرات الوعائية المساريقية جراحيا من الفئران. الخطوة الثانية هي تشريح وتنظيف أجزاء الشرايين المساريقية.

بعد ذلك ، يتم استخدام بعض الأجزاء لعزل خلايا العضلات الملساء الفردية لقياسات الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح لتيارات البوتاسيوم السبعة KV. الخطوة الأخيرة هي قنية الأجزاء الشريانية السليمة لقياسات الضغط العضلي لتضيق الشرايين أو التمدد استجابة للمعدلات الدوائية لسبع قنوات بوتاسيوم KV. في النهاية ، يتم استخدام الجمع بين الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح وتصوير عضل الضغط لإظهار كيف تؤثر الزيادة أو النقصان في نشاط قنوات البوتاسيوم السبع KV على انقباض الشرايين المساريقية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل استخدام قنوات الاستنساخ المعبر عنها في خطوط الخلايا ، هي أن التيارات يتم تسجيلها من الخلايا غير المستزرعة التي تعبر أصلا عن القنوات ويمكن عزل تيارات KV عن فئات أخرى من قنوات البوتاسيوم التي يمكن تنشيطها في نفس الخلايا. يسمح التصوير العضلي للضغط بتسجيل الاستجابات الوظيفية من نفس النسيج الذي اشتقت منه الخلايا المعزولة ، والطريقة أكثر حساسية وفسيولوجية من المستحضرات الأخرى مثل الحلقات الشريانية أو شرائط الشرايين. سيوضح الدكتور باريث ماني ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري ، تقنيات قنية الشرايين وتصوير العضل بالضغط ، وستقوم الدكتورة لوبا بروجمان ، الأستاذة المساعدة الباحثة في مختبري ، بتوضيح إجراءات عزل الخلايا وخطة التصحيح.

لبدء هذا الإجراء ، استخدم مقصا جراحيا لقطع جزء من 10 إلى 12 سم في طرفي الأمعاء الدقيقة للفئران. ثم اعزل الأمعاء مع الأوعية الدموية المرفقة بها. بعد ذلك ، حدد جزء من الأمعاء الدقيقة.

انشر المساريق على الجانب القريب من الغرفة بحيث يكون الفرع الأساسي للشريان المساريقي العلوي في الوسط ويشع الترتيب اللاحق للفروع من المركز. ثم ضع المسامير فقط على الأجزاء المعوية التي تتخيل من خلال مجهر تشريح مضيء. نظف بعناية الأنسجة الدهنية والنسيج الضام المحيط بالشرايين من الدرجة الثانية إلى الرابعة بالقرب من الأمعاء باستخدام ملقط دقيق ومقص.

امسك الأوردة المجاورة لتسهيل تطهير الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة وتجنب التمدد غير الضروري للشرايين. الآن انقل جزأين إلى ثلاثة أجزاء من الشريان المساريقي إلى طبق زراعة أنسجة 35 ملم يحتوي على ملليلترين من محلول العزل المثلج. ضع الطبق على الجليد بعد ذلك ، وقم بتقطيع شرائح الشريان المساريقي إلى قطع بطول ثلاثة إلى أربعة ملليمترات باستخدام PEs الماصة الخاصة بك بطرف مصقول بالنار.

نقل الأجزاء الشريانية إلى قارورة زجاجية تحتوي على ملليلترين من محلول عزل 37 درجة مئوية. ثم احتضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة ، قم بشفط محلول العزل 37 درجة مئوية بعناية باستخدام ماصة خلفية.

أضف ملليلترين من محلول الإنزيم الدافئ إليه ، ثم احتضنه لمدة 35 دقيقة عند 37 درجة مئوية. مباشرة بعد الحضانة لمدة 35 دقيقة في محلول الإنزيم ، ضع القارورة على الثلج ، واستنشق محلول الإنزيم وأضف ملليلترين من محلول عزل الجليد. كرر هذا الإجراء أربع مرات.

ثم في مليلتر واحد من محلول عزل الجليد البارد ، كرر الأجزاء الشريانية برفق باستخدام الماصة الخلفية المصقولة. 10 إلى 20 مرة لتحرير خلايا العضلات الملساء للشريان المساريقي الفردية. تحقق من ظهور الخلايا العضلية بشكل دوري عن طريق وضع قطرة من معلق الخلية على طبق 35 ملم وعرضها تحت المجهر.

يجب أن يكون ل MA SMCs الصحية مظهر ممدود ناعم. بعد ذلك ، انقل ما يقرب من 100 إلى 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة معجنة مصقولة واترك الخلايا تلتصق لمدة 15 دقيقة. في هذه الخطوة، املأ طرف ماصة التصحيح بمحلول داخلي خال من الأمفوتريسين B، عن طريق قلب طرف الماصة فيه.

ثم قم بتطبيق الشفط على الطرف الآخر باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر متصلة عبر قطعة من الأنابيب لإضافة معلومات terin B تحتوي على محلول ماصة من الأعلى. استخدم طرف ماصة اللودر الصغير einor حتى تمتلئ الماصة بمحلولها نصفها تقريبا. قم بإزالة أي فقاعات هواء عن طريق النقر برفق على الماصة.

بعد ذلك ، أدخل الماصة في حامل القطب. استخدم مناور دقيق لخفض الماصة إلى سطح الخلايا العضلية الممدودة. عندما تزداد مقاومة الماصة إلى ستة إلى 10 ميجا أوم، قم بتطبيق الشفط للحصول على ختم جيجا.

في الوقت نفسه ، اضبط جهد التثبيت على صفر مللي فولت أثناء انتظار ثقب الغشاء. بعد ذلك ، قم بتطبيق خطوات جهد 100 مللي ثانية لزائد 10 مللي فولت ثم إلى 10 مللي فولت تحت الصفر. استخدم مكبر الصوت للتعويض عن سعة الماصة السريعة العابرة المتزامنة مع ظهور سعة الخلية بأكملها.

التيارات الموجبة الصغيرة المستمرة العابرة من اثنين إلى 10 أمبير بيكو ، نقية وسعة إلى وجود قنوات KV وظيفية سبعة. سيقلل التثقيب الناجح باستخدام الأمفوتريسين B من مقاومة الوصول إلى 35 ميغا أوم أو أقل. لتسجيل علاقة الجهد الحالي السبعة KV ، قم بتطبيق خمس خطوات جهد ثانية على الفولتية التي تتراوح من سالب 84 مللي فولت حيث يكون الاحتمال المفتوح لسبع قنوات KV ضئيلا إلى زائد 16 مللي فولت حيث يصل الاحتمال المفتوح لسبع قنوات KV إلى هضبة بعد خمس ثوان عند كل جهد اختبار ، عد إلى جهد التثبيت عند سالب أربعة مللي فولت لمدة 10 ثوان.

في هذا الإجراء ، قم بتعليق خيوط نايلون ناعمة مسبقة الصنع على كل جانب. بجوار القنية الزجاجية ، نقلت بعناية جزء الشريان المساريقي المفصل من غرفة التشريح إلى غرفة الكسب غير المشروع العضلي بالضغط عن طريق الإمساك بأحد طرفي الجزء باستخدام زوج من الملقط الدقيق. بعد ذلك ، تصور من خلال مجهر تشريح مضيء ، أمسك أحد طرفي جزء الشريان وحركه برفق فوق القنية الزجاجية اليسرى.

قم بتأمين النهاية باستخدام خيوط النايلون. ثم اغسل سائل التجويف برفق من خلال الوعاء المركب لإزالة الدم والحطام. يجب بعد ذلك إغلاق الصمام الموجود في المحقنة اليسرى بحيث يقدم هذا الجانب عمودا ثابتا من السائل يتم ضبط الضغط ضده من الجانب الأيمن ، باستخدام المناور الصغير ، ضع القنية الزجاجية اليمنى المتحركة بالقرب من جزء الشريان واسحب الطرف الأيمن من الجزء فوقه.

أخيرا ، قم بتأمين جزء الشريان بخيوط النايلون وقم بقص خيوط الخياطة الزائدة. الآن قم بتركيب وحدة الرسم البياني للضغط على المسرح فوق مجهر الضغط. قم بتوصيل عمود الضغط بالجانب الأيمن من حجرة الرسم البياني ثم ضع الغطاء فوق الغرفة.

ارفع المحقنة سعة 10 مليلتر تدريجيا على مدى 15 دقيقة وتحقق من وجود أي تسرب في الوعاء حتى يقرأ محول الضغط P واحد 80 ملم زئبق اضبط المسافة بين القنية عند الضرورة ، يجب ضبط المسافة بحيث يكون جزء الشريان المضغوط مستقيما تقريبا ويشكل نمطا يشبه الكتف حيث يتم إجراء الروابط. تحقق من صلاحية الوعاء المركب عن طريق الاندماج العابر باستخدام 60 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم لمدة 30 ثانية. ينقبض الوعاء القابل للحياة بسرعة مع إضافة كلوريد البوتاسيوم ويتوسع فور غسله.

بعد ذلك، أضف مادة الاختبار المركزة إلى محلول الحمام مباشرة، وقم بتثبيتها ذهابا وإيابا برفق بالقرب من نهاية الغرفة لخلط مادة الاختبار في محلول الحمام، مما ينتج عنه التركيز النهائي المناسب في حجرة 10 ملليلتر. يمكن رصد تغيرات الحجم في قطر الوعاء بعد إضافة مادة الاختبار في صورة الفيديو الحية وأيضا رسمها في نافذة تحليل الصور أثناء إجراء التجربة. يوضح هذا الشكل عائلة من آثار التيار المتسلسل المسجلة استجابة لخطوات الجهد قبل العلاج كما هو موضح باللون الأسود وبعد التثبيت في وجود 100 نانومولار من الزنك في خلية عضلية شريان مساريقية واحدة كما هو موضح باللون الأحمر ، وفيما يلي التيارات التمثيلية للتحكم و 100 نانومولار من الزنك بيريون.

تشير الأشرطة الرمادية إلى الفاصل الزمني حيث تم قياس متوسط السعات الحالية بالنسبة لمخططات الجهد الحالي ، يشار إلى الفولتية المتدرجة على اليمين بواسطة رؤوس الأسهم. هذا هو المسار الزمني لسبعة تعزيز تيار KV بواسطة 100 نانومولار من الزنك perion مقاس بمشبك جهد مستمر عند 20 مللي فولت تحت الصفر. تفعيلك. فيما يلي متوسط منحنيات الجهد الحالي المستمدة من KV سبعة كثافات تيار مسجلة من قبل أثناء العلاج ب 100 نانومولار من الزنك بيريون ، وأثناء العلاج ب 10 ميكرومولار من مانع القنوات السبع KV XC 9 9 1 استرخاء أيون الزنك المستحث للشريان المساريقي المقبض مسبقا مع 100 فازوبريسين أرجينين بيكومولر.

يوضح هذا الشكل المسار الزمني للتغيرات في القطر الخارجي للوعاء استجابة لتطبيق 100 فازوبريسين أرجينين بيكومولار ، متبوعا بتطبيق 100 أيون زنك نانومولار. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الشرايين لعزل الخلايا المفردة أو لقياس الرسم البياني للضغط العضلي لانقباض الشرايين ، واستجابات الموسع. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تعرف كيفية تسجيل تيارات KV السبعة بمعزل عن التيارات الأخرى في الخلايا العضلية الشريانية المعزولة حديثا.