تسجيلات المشبك التصحيح في الأذن الداخلية خلايا الشعر المعزولة من اسماك الزرد

والغرض من هذا الفيديو هو إظهار إجراءات الحصول على صحي، وخلايا الشعر سليمة من الأجهزة الأذن الداخلية من الزرد الكبار ومن ثم استخدامها للدراسات المشبك التصحيح تهدف إلى تحديد خواص الفيزيائية الحيوية من القنوات الجهد بوابات بهم.

الهدف من هذا الإجراء هو توضيح طرق الحصول على خلايا شعر صحية وسليمة من الأعضاء السمعية والدهليزية لأسماك الحمار الوحشي البالغة بحيث يمكن استخدامها في مشابك التصحيح. تهدف الدراسات إلى توصيف الخصائص الفيزيائية الحيوية لقنواتها ذات الجهد المسور. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الدماغ أولا من الأسماك ثم إخراج الجزء البطني من علبة الدماغ التي تحتوي على المتاهات.

الخطوة الثانية هي تفكيك وعاء العظام من أجل عزل المتاهات التي تحتوي على الأعضاء الطرفية ، والليجا S ، والقنوات العظمية ، والقنوات نصف الدائرية. بعد ذلك ، يتم استخدام شعر للرفع من الأعضاء الطرفية ، تلك الصفائح الظهارية التي تحتوي على خلايا الشعر. الخطوة الأخيرة هي عزل خلايا الشعر الفردية عن طريق تنظيم الألواح الظهارية بشعرين من.

في النهاية ، يمكن إجراء تسجيلات مصباح التصحيح على خلايا الشعر المعزولة لتوصيف خصائص القنوات ذات الجهد المسور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها توضح كيفية الحصول على خلايا شعر قابلة للحياة من الكائن الحي النموذجي لسمك الزرد القابل للتتبع وراثيا. يمكن استخدام هذه الطريقة للمساعدة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فسيولوجيا السمعة والدهليزية ، مثل تلك التي تسعى إلى فهم الآليات التي تتحكم في إطلاق الناقلات العصبية من الخلايا التي تتوسط السمع والتوازن.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد ستة حلول مختلفة وفقا للمخطوطة المصاحبة. بعد ذلك قم بتسمية واملأ 4 أطباق بتري مقاس 35 ملم في منتصف الطريق تقريبا بالحلول الموضحة في المخطوطة المصاحبة. بعد ذلك ، قم بإعداد طبق تشريح عن طريق قطع تجويف على شكل سمكة في طبق بتري 60 ملم مليء بواقي السيل المعالج.

سيمنع ذلك من الانقلاب أثناء التشريح. قم بإعداد أداتين على الأقل لعزل الخلايا عن طريق لصق نهاية بصيلات شعر بنهاية ماصة المعكرونة الزجاجية بالغراء الفائق ، مما يسمح للشعر بالتمدد إلى ما وراء نهاية الماصة بحوالي 0.5 سم. الآن ، ضحي بسمكة حمار وحشي بالغة عن طريق غمرها في دورق يحتوي على جرس أسماك الحمار الوحشي العادية أو NZR و trica.

راقب الخياشيم بصريا حتى تتوقف جميع الحركات الأذنية. انتظر 10 دقائق إضافية على الأقل قبل إزالة السمك وشطفه ب NZR الطازج. بعد ذلك. ضع السمك في طبق التشريح مع وضع جانبه الظهري لأعلى.

أدخل دبوسا مستقيما قياسيا واحدا من خلال كل تجويف للعين ، ودبوس ثالث من خلال المحور البطني الظهري. حوالي ثلث إلى نصف المسافة من الرأس إلى الذيل تحت مجهر تشريح ستيريو تكبير ، قم بتعريض الدماغ وجزء قصير من الحبل الشوكي عن طريق إزالة سقف الجمجمة من نقطة حوالي 0.5 سم كوردالية إلى مستوى الخياشيم إلى أنف السمكة باستخدام زوج من مقص الربيع. ثم قطع الحبل الشوكي ورفع الدماغ بالملقط الدقيق أثناء قطع الأعصاب والمرفقات الأخرى.

بعد ذلك ، قم بإزالة الدماغ والتخلص منه. يشكل الجزء البطني المتبقي من كبسولة الجمجمة وعاءا يحتوي على أعضاء الأذن الداخلية. لاحظ otoliths البيضاء غير الشفافة البارزة في legina و sculli الموجودة بشكل متماثل في نهاية ربع كل أذن داخلية وتقع otoliths utricle الموضوعة بشكل جانبي.

أكثر إحصاء. هذه الهياكل هي معالم مفيدة للمساعدة في الإزالة السليمة للمتاهة باستخدام زوج من الملقط الناعم ومقص الربيع. قم بإزالة وعاء العظم عن طريق قطع جميع المرفقات البطنية والجانبية مع رفعه برفق إلى خارج الرأس.

ضعه في طبق بتري الذي يحتوي على محلول منخفض الكالسيوم أو منخفض الكالسيوم بعد ذلك. قم بفصل الوعاء عند خط الوسط ، وافصل النصفين الأيمن والأيسر عن طريق إدخال نقاط الملقط الدقيق في المنتصف وفصل النصفين عن بعضهما البعض. ثم قم بإزالة المتاهتين من العظم.

افحص المتاهات وحدد الأعضاء السمعية والدهليزية. القنوات نصف الدائرية ، يوراسيل ، سكالي ، وليجينا. قم بإزالة الرائحة بعناية من الليجينا والأذن باستخدام ملقط ناعم.

في هذا الإجراء ، انقل الأعضاء النهائية إلى الطبق الذي يحتوي على المكانات والبروبان. باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، احتضن هذه الهياكل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة الحضانة ، انقل الهياكل إلى الطبق الذي يحتوي على NZR و BSA واحتضنه لمدة 30 دقيقة على الأقل.

المزيد للتحضير لعزل الخلايا. انقل أحد الأعضاء الطرفية ، على سبيل المثال ، legina إلى الطبق الذي يحتوي على NZR. ثم يتم وضع هذا الطبق على مسرح مجهر تشريح تكبير ستيريو.

استخدم شعر لرفع البقعة برفق ورقة الأنسجة الظهارية الوردية التي تحتوي على خلايا الشعر. يمكن أيضا إزالة الصولجان من sculli و uracil ، ويمكن عزل kae من مواقعها داخل القنوات نصف الدائرية. باستخدام اثنتين من أدوات عزل الخلايا التي تم إعدادها مسبقا ، قم بتدوير البقعة لتوليد حقل حطام يحتوي على خلايا الشعر.

اترك الخلايا لمدة خمس دقائق على الأقل لتستقر في القاع قبل تحريك الطبق. بعد ذلك ، انقل الطبق إلى مرحلة المجهر المقلوب المجهز بصريات تباين الوجه. راقب الخلايا تحت تكبير 40 مرة.

لاحظ التنوع في مورفولوجيا الخلية. بعض الخلايا على شكل أفوكادو بينما البعض الآخر طويل ورقيق. يشير وجود حزم الشعر القمي إلى خلايا الشعر ويضمن سطوع الطور صحتها.

بالنسبة لتسجيلات التصحيح المثقبة، قم بإعداد محلول يحتوي على الأمفوتريسين عن طريق وضع خمسة ملليغرامات من الأمفوتريسين B أولا في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 100 ميكرولتر من DMSO وقم بتدوير الأنبوب على الفور لمدة 10 إلى 20 ثانية حتى يذوب كل الأمفوتريسين. بعد ذلك ، ضع الماصة 625 ميكرولترا من المحلول الداخلي لأيون البوتاسيوم في أنبوب طرد مركزي صغير ثان.

ثم أضف 10 ميكرولترات من محلول الأمفوتريسين إلى المحلول الداخلي لأيون البوتاسيوم وقم بتدويته لمدة 10 إلى 20 ثانية أخرى. قم بتصنيع ماصات رقعة من خيوط تحتوي على أنابيب شعرية من زجاج سيليكات البورو. باستخدام مجتذب متعدد المراحل ، يجب أن يكون للماصة أقطار مائلة تبلغ حوالي ميكرون ومقاومة بين واحد وثلاثة ميجا أوم.

يفضل استخدام الماصات الحادة على شكل رصاصة لأنها توفر أقل مقاومة للوصول أثناء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. بعد ذلك، استخدم إبرة حقنة ميكروفيل قياس 28 لملء ماصة التصحيح في منتصف الطريق بالأمفوتريسين الذي يحتوي على محلول داخلي لأيون البوتاسيوم. قم بتثبيت هذه الماصة على مرحلة رأس مكبر الصوت المشبك الرقيع لتمكين تسجيلات مشبك التصحيح.

أولا ، قم بالضغط الإيجابي على القطب الكهربائي أثناء خفضه من خلال واجهة محلول الهواء ونزولا إلى أسفل طبق التسجيل بالقرب من الخلايا. بعد ذلك ، ضع القطب بشكل متعامد على خلية ذات مظهر صحي. عندما يكون القطب قريبا بدرجة كافية بحيث تبدأ الخلية في الابتعاد عن المحلول المتدفق ، اعكس الضغط بسرعة مما يؤدي إلى حدوث فراغ طفيف في القطب حتى تقفز الخلية عليه.

توقف فورا عن الشفط على القطب للسماح بتكوين ختم جيجا أوم مع الخلية. قم بتطبيق خطوات جهد مفرط الاستقطاب المتكررة بمقدار 10 مللي فولت على القطب الكهربائي ولاحظ عابر التيار السعوي. استمر في مراقبة ثقوب الغشاء الناجمة عن الأمفوتريسين حيث ينمو حجم العابر إلى أقصى حجم لها.

لتأكيد إنشاء تكوين التصحيح المثقوب في خلية سليمة ، قم باستماد تيارات بوابات الجهد عن طريق تطبيق خطوات فرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب المحتملة. تحتوي معظم خلايا الشعر على تيارات خارجية بارزة تتوقف بسرعة أثناء إزالة الاستقطاب المستمرة. يوضح هذا الشكل الجزء البطني من حالة الدماغ بعد إزالة الدماغ.

يمكن رؤية otoliths المرتبطة بالتولو والجنس والسكالي ، وكذلك تلك المرتبطة بالاثنين من خلال العظم الرقيق الذي يغطيها بعد إزالة وعاء العظام. يساعد وجود otoliths على تحديد موقع المتاهات. يشير خط الاندفاعة في الرسوم المتحركة إلى المحيط التقريبي للمتاهة اليسرى.

عندما يتم عزل المتاهة ، يمكن تحديد الأعضاء السمعية والدهليزية مثل القنوات s ، واللجينا ، والأوريسل ، والقنوات نصف الدائرية. يوضح الرسم الكاريكاتوري موقع هذه الهياكل ، A و B و C للقنوات نصف الدائرية. D هي utricle ، و E هي s ، و f هي lega.

يتضح التنوع في مورفولوجيا خلايا الشعر في هذا الشكل من الخلايا المعزولة عن lega. تنقسم الخلايا تقريبا إلى فئتين ، إما رقيقة أو على شكل أفوكادو. الخلايا السليمة مشرقة على مراحل مع خطوط حادة وحزم شعر واضحة على النقيض من ذلك.

الخلايا الميتة الموضحة هنا في الجزء الداخلي B لها مظهر أسود حبيبيبي. يوضح هذا الشكل متوسط الاستجابات في الخلية لثلاث عروض لخطوات الجهد المطبقة بزيادات قدرها 10 مللي فولت من سالب 140 مللي فولت إلى زائد 70 مللي فولت مع إمكانية الاحتفاظ ب 70 مللي فولت تحت الصفر. لاحظ أن تيار التعطيل يظهر عند إمكانات أكثر إزالة الاستقطاب.

بمجرد إتقان ، يمكن أخذ تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية في أقرب وقت 90 دقيقة من بداية الإجراء. علاوة على ذلك ، إذا تم تأجيل الخطوة الثلاثية وتم الاحتفاظ بالأعضاء النهائية في BS ، يمكن الحصول على محلول ، يمكن الحصول على الخلايا السليمة لمدة تصل إلى أربع ساعات بعد بدء التشريح. يوفر هذا المستحضر عند استخدام الجمع مع الطفرات الجينية لسمك الزرد المتاح على نطاق واسع نظاما نموذجيا فريدا للتحقيق في العوامل الجزيئية التي تكمن وراء آليات عدم توازن السمع.