Name: تربية وحقن ماندوكا سيكستا اليرقات لتقييم الفوعة البكتيرية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: تعلم تقييم الفوعة البكتيرية في يرقات الحشرات باستخدام Manduca sexta كنموذج حي. يتضمن التربية من البيض المعقم والحقن المباشر في الجسم، مما يساعد الباحثين على دراسة تفاعلات المضيف مع البكتيريا.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب أود أن أشكر أعضاء الماضية من مختبر غوودريتش وبلير: سامانثا بستان، كولز كيمبرلي، ايرين هربرت-تران، ريتشاردز جريج، ميغان مينار، وبارك Youngjin لما قدموه من مساهمات في تطوير هذا البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية منحة IOS-0950873 والمعاهد الوطنية للصحة الزمالة FAI084441Z NRSA.

1. الحشرات تعقيم البيض وتربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد النظام الغذائي من جانب أول مجموعة ال 15 للأجار التعقيم المنصوص عليها في 900-1،000 مل O. 2 H مباشرة بعد التعقيم، مع مزيج القمح 166 جم النظام الغذائي والجرثومية الخليط جيدا في الخلاط المختبر. تصب في طبق (أو الأطباق) لتبرد، ثم نقل إلى النظام الغذائي رقائق الألومنيوم، والتفاف بإحكام، وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لدى وصوله، تعقيم M. البيض سيكستا مع 250 مل من محلول التبييض 0.6٪ لمدة 2-3 دقيقة في حامل الزجاج فراغ جهاز تصفية وقارورة مع ورقة مرشح 90 مم، واحيانا اثارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الفراغ لاستنزاف حل التبييض وغسل البيض 3-4 مرات مع 250 مل العقيمة O 2 H المقطر في الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيض إلى ورقة جديدة مم 90 مرشح وضعت في غطاء لوحة بيتري والسماح لهم لتجف حتى أنها لم تعد عصا معا (حوالي 20-30 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيض إلى أسفل الحاويات البلاستيكية التي تحتوي على نظام غذائي الحشرات، ووضع ما يقرب من 40 بيضة في كل حاوية(الشكل 1A). يتم فصل البيض من النظام الغذائي لمنع الرطوبة التي يسببها التلوث الفطرية. الحفاظ على البيض حتى 26 ° C مع ضوء HR 16: 8 ساعة الضوئية الظلام. سوف يخفف البيض إلى اللون الأصفر والأبيض قبل الفقس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الفقس اكتمال نقل ما يقرب من 25 يرقات بعناية كل لحاويات جديدة مع النظام الغذائي على الجزء السفلي (1B الشكل). من المهم أن تلتقط كل يرقة من القرن الأفريقي الأسود الطويل باستخدام ملقط لتجنب إلحاق الأذى بهم خلال مراحلها التنموية الهشة في وقت مبكر. احتضان لمدة 2 يوم على النحو الوارد أعلاه. بينما الموت اليرقات غير المعتاد في هذه المرحلة، يمكن ملاحظة بعض القتلى أو، على الأرجح، يرقات توقف تنمويا. ينبغي استبعاد مثل هذه الحشرات من مزيد من الدراسة وضحت من قبل التجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب السلوكيات أكل لحوم البشر، نقل اليرقات إلى حاويات فردية مع قطع صغيرة من الطعام (الشكل 1C) واحتضان على النحو الوارد أعلاه. رصد نمو الحشرات، البراز استبدال الطعام وتنظيف أووطن من الحاويات كل يوم حتى الخضوع لتساقط اليرقات الثالثة (عادة 6-9 يوم بعد الفقس). هذا هو ال 4 المرحلة الرابعة الطور اليرقي، وتتميز بظهور الكروشيهات الذي يشبه الخطاف الأسود على كل بروز proleg وزيادة المشارب على طول الجسم الحشرات (1D الشكل). قد تختلف اختلافا كبيرا في يرقات الحجم، ولكن عادة تزن 0،15-0،4 ز عند دخول مرحلة الطور ال 4. وينبغي اختيار اليرقات مشابهة من حيث الحجم للحقن. </li></ol> 2. إعداد البكتيريا للحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو سلالة بكتيرية (ق) لفحصها وفقا للإجراءات القياسية لمرحلة النمو التي ترغب في اختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفحصها بيليه 500 ميكرولتر من كل سلالة بكتيرية من خلال الدوران لمدة 2 دقيقة في ميكروسنتريفوج في 13000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا مخزنة resuspend في 1 مل الفوسفات المالحة عقيمة 1X (PBS) وبيليه مرة أخرى على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X 0.5 مل العقيمة والشرق الأوسط وأفريقياتأكد من أن الكثافة الضوئية (OD) من التعليق. تمييع كل تعليق إلى OD نفسه، إذا لزم الأمر. ويمكن أيضا وسائل الإعلام نمو معقمة يمكن استخدامها لإعادة تعليق خلية والتخفيف بدلا من 1X PBS، إذا رغبت في ذلك. </li></ol> 3. حقن من 4 ال يرقات الطور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المسلسل أضعاف التخفيفات 10-سلالة بكتيرية الأولى في 6 آبار من لوحة عيار مكروي 96-1X PBS جيدا في معقمة، وذلك باستخدام معلومات سرية ماصة جديدة لكل التخفيف (الشكل 2A). ينبغي أن الحجم النهائي للتعليق خلية في كل بئر يتجاوز حجم المطلوب للحقن (10 ميكرولتر لكل الحشرات) بالإضافة إلى 20 ميكرولتر لوحة واللقاح (انظر الخطوات 3.2 و 3.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ميكرولتر كل بقعة لمدة 5 التخفيفات (10 -2 من خلال 10 -6) على طول الجزء العلوي من لوحة تحتوي على بيتري المتوسطة النمو المناسبة. إمالة لوحة بحيث تنتشر البقع إلى مركز (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النظام الغذائي الحشرات والبراز والحشرات مكان في حاويات على الجليد للحوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الإبرة حقنة وذلك بدهن كل 3 مرات في 2 أنابيب من الإيثانول 70-100٪، تليها أنبوب واحد من العقيمة O 2 H (الشكل 2C). يجب أن يكون حجم السائل كافية لغمر الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quantitate على تعليق خلية المخففة تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات. اعتمادا على اللقاح المطلوب، ووضع 10 ميكرولتر من عيار مكروي المناسبة أيضا (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسحة السطح الحشرات مع الايثانول 95٪، وحقن الخلية 10 مل التعليق في الحشرات في زاوية (أقل من 45 درجة) وراء واحدة من prolegs البطن. والحرص على عدم ثقب الأمعاء وحقن محتويات فقط تحت طبقة البشرة (2E الشكل). في حين أن بعض الخسائر في الدملمف (واضحة، الأخضر والأزرق السائل) أمر طبيعي، والجسيمات الناشئة سائل أصفر من موقع الحقن تدل على ثقب الأمعاء. إذا حدث هذا، التضحية الحشرات والحصول على يرقة جديدة لإعادةوضعه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 3.6 للكل الحشرات الباقية في المجموعة الحقن الأولى. إبرة التعقيم ليس من الضروري بين كل الحشرات حقن نفسه مع التخفيف وسلالة من البكتيريا ما لم يحدث التلوث. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام موزع لتكرار قدر أكبر من الاتساق في حجم الحقن بين العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن كل الحشرات مع سلالة الأولى من البكتيريا، كرر الخطوة 3.2، هذه المرة اكتشاف تعليق خلية في منتصف لوحة والسماح لهم تدفق نحو الأسفل (الشكل 2F). احتضان لوحات في درجة حرارة مناسبة والاعتماد المستعمرات تعداد اللقاح. يتم استخدام هذه الخطوة الثانية لطلاء تحقق من لم تلوث عينات أثناء عملية الحقن، حيث أن هذا من شأنه أن يؤدي بأعداد متباينة بين مستعمرة التصفيح الأولى والثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.1 خلال 3.8 لكل سلالة من البكتيريا في التجربة. وأخيرا، وضخ 3-5 الحشرات العقيمة مع 1X PBS باستخدام ster يسودإيل إبرة كمجموعة مراقبة سلبية. احتضان الحشرات في C ° 26 مع ضوء HR 16: 8 ساعة الضوئية الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد الحشرات البقاء على قيد الحياة على مر الزمن بعد الحقن. ويتميز فاة الحشرات وعدم وجود حركة الطوعية على التحفيز. غالبا ما تظهر الحشرات فقدان الشهية، والإسهال (المائي، والبراز أصفر)، و / أو فقدان المياه (&quot;التعرق&quot;) خلال العدوى قبل وفاته، وهذه الخصائص قد تكون الجدير بالذكر أيضا. </li></ol>

<ol><li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li>
<li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li>
<li>Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li>
<li>Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+%28Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li>
<li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+histidine+kinase%2C+EnvZ%2C+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li>
<li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li>
<li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li>
<li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li>
<li>Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project">http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project</a> (2012).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li>
<li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li>
<li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li>
<li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li>
<li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism%2C+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li>
<li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus%3A+two+roads+to+the+same+destination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li>
<li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modulation+of+immunity%3A+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li>
<li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

والحقن المباشر للM. سيكستا اليرقات مع البكتيريا الممرضة للحشرات، كما هو موضح هنا، بمثابة وسيلة بسيطة وفعالة لتحليل الفوعة الجرثومية. الأسلوب هو أيضا قابلة للتكيف للغاية لتناسب مختلف المواضيع التجريبية و / أو شروط. يمكن تحضير البكتيريا بطرق مختلفة قبل الحقن. في حالة X. nematophila، وخلايا النوع البري المزروع في المواد الغذائية الغنية المتوسطة (LB) لوريا Bertani-إلى منتصف سجل المرحلة عادة ما تكون أكثر ضراوة، مما أسفر عن مقتل أكثر الحشرات أو في غضون 30 ساعة فقط بعد ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 90 مم رقة الترشيح </td><td> WHATMAN </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> مرشح الزجاج حامل </td><td> ميليبور </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> ماندوكا سيكستا البيض </td><td> كارولينا البيولوجي التموين </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> الغجر العثة حمية + أجار </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5 أوقية. البلاستيك الحاويات وأغطية </td><td> كأس منفردا الشركة </td><td> URC55-0090-0090 PL4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 أوقية. البلاستيك الحاويات وأغطية </td><td> DART حاوية شركة </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 8 مم نا 2 HPO 4، 1،46 ملم KH 2 PO 4، درجة الحموضة 7.4 </td></tr><tr><td> محقنة </td><td> هاميلتون </td><td> 80208 </td><td> 30 عداد، 0،375 &quot;على غرار طول نقطة، 2 </td></tr></tbody></table>

تربية وحقن<em&gt; ماندوكا سيكستا</em&gt; اليرقات لتقييم الفوعة البكتيرية

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

ويعتبر ماندوكا سيكستا، المعروف باسم hornworm التبغ، آفة كبيرة الزراعية، وتغذية النباتات على باذنجاني بما في ذلك التبغ والطماطم. قابلية M. سيكستا اليرقات إلى مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية الممرضة للحشرات 1-5، فضلا عن ثروة من المعلومات المتاحة عن نظام الحشرة المناعة 6-8، وتسلسل الجينوم انتظار 9 جعله كائن نموذج جيد للاستخدام في دراسة المضيف ميكروب التفاعلات خلال المرضية. وبالإضافة إلى ذلك، M. سيكستا يرقات كبيرة نسبيا وسهلة للتلاعب والحفاظ على النسبية في المختبر لأنواع أخرى عرضة للحشرات. حجمها كبير كما يسهل كفاءة الأنسجة / الدملمف استخراج لتحليل استجابة العائل للإصابة. الأسلوب المعروضة هنا يصف الحقن المباشر للبكتيريا في hemocoel (تجويف الدم) من M. سيكستا اليرقات. هذا النهجيمكن استخدامها لتحليل ومقارنة خصائص الفوعة الأنواع البكتيرية المختلفة، سلالات، أو ببساطة من خلال مراقبة طفرات الوقت حتى الموت الحشرات بعد الحقن. وقد تم تطوير هذه الطريقة لدراسة تسببها Xenorhabdus والأنواع Photorhabdus، والتي عادة ما تربط مع ناقلات الديدان الخيطية كوسيلة للدخول في الحشرات. النيماتودا الممرضة للحشرات تصيب اليرقات عادة عن طريق الجهاز الهضمي أو فتحات الجهاز التنفسي الطبيعية، والافراج عن محتوياتها البكتيرية التكافلية في الدملمف الحشرات (الدم) بعد فترة وجيزة 10. طريقة الحقن الموصوفة هنا يتجاوز الحاجة إلى ناقلات الديدان الخيطية، وبالتالي uncoupling آثار البكتيريا والديدان الخيطية على الحشرات. هذا الأسلوب يسمح للتعداد دقيق للمواد المعدية (الخلايا أو البروتين) في اللقاح، وهو أمر غير ممكن باستخدام طرق أخرى موجودة لتحليل entomopathogenesis، بما في ذلك الخدش 11 و فحوصات السمية عن طريق الفم 12 <eم&gt;. أيضا، فحوصات السمية عن طريق الفم معالجة الفوعة من السموم يفرز التي أدخلت على الجهاز الهضمي من اليرقات، في حين أن طريقة الحقن المباشر يتناول ضراوة خلية كاملة قائح. الأداة المساعدة لطريقة الحقن المباشر كما هو موضح هنا هو تحليل المرضية البكتيرية من خلال رصد وفيات الحشرات. ومع ذلك، يمكن بسهولة هذه الطريقة يتم توسيع لاستخدامها في دراسة آثار العدوى على M. سيكستا الجهاز المناعي. الحشرة يستجيب للإصابة عن طريق كل من الاستجابات الخلطية والخلوية. الاستجابة الخلطية يتضمن الاعتراف البكتيرية المرتبطة أنماط الإنتاج واللاحقة من الببتيدات المضادة للميكروبات المختلفة 7؛ يمكن رصدها في التعبير عن الجينات ترميز هذه الببتيدات لاحقة للإصابة المباشرة عبر استخراج الحمض النووي الريبي والكمية PCR 13. الاستجابة الخلوية للإصابة ينطوي تكوين العقد الجذرية، التغليف، والبلعمة من العوامل المعدية عن طريق hemocytes 6 </sup&gt;. لتحليل هذه الاستجابات، يمكن تشريح الحشرات وحقن المجهري تصور من قبل 13 و 14.

ويصور A سبيل المثال ممثل لفحص الحشرات وفيات في الشكل 3. في هذه التجربة، تم حقن الحشرات مع وحدات مستعمرة تشكيل ما يقرب من 50 (CFU) من أي نوع البرية (ATCC19061) أو سلالة متحولة الموهن (الدوريات طويلة المدى 13) من nematophila Xenorhabdus نمت لمنتصف المرحلة سجل (ن = 6 الحشرات في سلالة). وقد لوحظت الحشرات لحوالي 72 ساعة، وسجلت في المئة من الحشرات حقن لا يزال حيا في كل timepoint. في هذه الحالة، عرضت سلالة موهنة تأخير واضح في قتل الحشرات، وال...

وصف الأسلوب هنا يستخدم الحقن المباشر للبكتيريا الممرضة للحشرات في hemocoel من<em&gt; ماندوكا سيكستا</em&gt; يرقات الحشرات.<em&gt; M. سيكستا</em&gt; هو حشرة المتاحة تجاريا ومدروسة. وبالتالي، هذا الأسلوب يمثل نهجا بسيطة لتحليل التفاعلات المضيفة للبكتيريا من منظور واحد أو الشركاء على حد سواء.

تُعتبر حشرة Manduca sexta، المعروفة باسم دودة تبغ القرن، آفة زراعية خطيرة، حيث تتغذى على النباتات الباذنجانية بما في ذلك التبغ و...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم القدرة الإمراضية البكتيرية ضد يرقات الحشرات باستخدام *Manduka seca* ككائن نموذجي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تربية يرقات الحشرات من بيوض معقمة حتى مرحلة الطور الرابع من النمو. وفي الخطوة الثانية، يتم تحضير العينات البكتيرية للحقن.بعد ذلك، يتم حقن البكتيريا في يرقات manduka seca في الطور الرابع. وفي الخطوة الأخيرة، يتم مراقبة موت الحشرات بمرور الوقت بعد الحقن. وفي النهاية، يتم تسجيل الوقت المستغرق لموت الحشرة واستخدامه لتقييم ضراوة البكتيريا.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة جوانب رئيسية في مجال التكافل، بما في ذلك اكتشاف مسببات أمراض حشرية جديدة وتحديد الاختلافات في الفوعة بين الأنواع أو السلالات البكتيرية. ابدأ أولاً بتعقيم 15 grams من auger في 900 to 1000 milliliters من الماء باستخدام الموصدة (autoclave). فور الانتهاء من عملية التعقيم.اخلط المثقاب مع 166 grams من نظام جنين القمح الغذائي. صب النظام الغذائي للحشرات الممزوج في طبق باستخدام خلاط مختبري. وعندما يبرد، انقل النظام الغذائي من الطبق إلى قطعة من ورق الألمنيوم.غلفها بإحكام وخزنها عند درجة حرارة 4 °C. وعند وصولها، ضع بيوض M sex في جهاز حامل مرشح زجاجي ودورق تفريغ مزود بورقة ترشيح بقطر 90 millimeter. بعد ذلك، صب 250 milliliters من محلول مبيض بتركيز 0.6% فوق البيوض لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق مع التقليب من حين لآخر.قم الآن بتشغيل المكنسة الفراغية لتصريف محلول المبيض، ثم اغسل البيض المعقم من ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 250 milliliters من الماء المقطر المعقم في كل غسلة. بعد ذلك، ضع قطعة جديدة من ورق الترشيح بطول 90 millimeter في غطاء طبق بتري، ثم انقل البيض إلى ورق الترشيح لتركه يجف في غطاء التدفق الرقائقي (flow hood) حتى لا يعود ملتصقاً ببعضه البعض. الآن، ضع الغذاء الحشري الذي تم تحضيره مؤخراً فوق سدادة مطاطية مثبتة في عدة حاويات بلاستيكية، وانقل حوالي 40 بيضة إلى كل حاوية، مع فصل البيض عن الغذاء لمنع التلوث الفطري الناجم عن الرطوبة.يتم الحفاظ على البيض عند درجة حرارة 26 °C مع فترة ضوئية تتكون من 16 ساعة من الضوء وثماني ساعات من الظلام. سيتحول لون البيض إلى اللون الأبيض المصفر قبل الفقس، وعندما تكتمل عملية الفقس، استخدم الملقط لالتقاط كل يرقة من القرون السوداء الطويلة، ثم انقل بعناية حوالي 25 يرقة إلى كل حاوية جديدة تحتوي على الغذاء في القاع.تُحضن اليرقات لمدة يومين تحت نفس الظروف المخصصة للبيوض، وبينما يُعد موت اليرقات غير شائع في هذه المرحلة، قد يُلاحظ وجود بعض اليرقات الميتة أو الأكثر احتمالاً اليرقات التي تعاني من تعثر في النمو. الآن، تُنقل اليرقات إلى حاويات فردية تحتوي على قطع صغيرة من الغذاء لتجنب سلوكيات الافتراس الذاتي، ثم تُحضن مرة أخرى. يُستبدل الغذاء وتُنظف الفضلات من الحاويات كل يومين حتى تمر الحشرات بعملية الانسلاخ اليرقي الثالثة.يعتبر الانسلاخ اليرقي الثالث المرحلة اليرقية الرابعة التي تتميز بظهور خطاطيف سوداء تشبه الكلابات على كل قدم كاذبة، وبزيادة وضوح الخطوط الممتدة على طول جسم الحشرة. بعد استزراع السلالات البكتيرية المراد اختبارها، يتم تدوير 500 µL من كل سلالة بكتيرية لمدة دقيقتين في جهاز طرد مركزي دقيق بسرعة 17,000 ×g في درجة حرارة الغرفة. ثم تُغسل الرواسب في 1 mL من محلول PBS المعقم تحت الظروف نفسها.بعد إعادة تعليق الخلايا في نصف مليلتر آخر من PBS المعقم، قم بقياس الكثافة الضوئية للمعلقات قبل البدء في عمليات الحقن. باستخدام طرف ماصة جديد لكل تخفيف، قم بإعداد ستة تخفيفات متسلسلة بمعامل 10 للسلالة البكتيرية الأولى في PBS المعقم في لوحة معايرة دقيقة ذات 96 بئراً. الآن، قم بتنقيط 10 µL من كل تخفيف، من 10⁻² إلى 10⁻⁶ على طول الجزء العلوي من طبق بتري يحتوي على وسط النمو المناسب. ثم قم بإمالة الطبق بحيث تنتشر النقاط نحو المركز.بعد ذلك، وبعد إزالة غذاء الحشرة والفضلات، توضع حاويات الحشرات على الثلج لمدة خمس دقائق تقريبًا حتى تبرد الحشرات. تُشطف إبرة المحقنة ثلاث مرات في كل من أنبوبين يحتويان على إيثانول بتركيز 70 إلى 100%، يليهما أنبوب واحد من الماء المعقم. ثم يُستخدم مقياس كرات الدم (hemocytometer) لتقدير كمية معلقات الخلايا المخففة تحت المجهر.اعتمادًا على اللقاح المطلوب، اسحب 10 µL من الفجوة المناسبة في طبق المعايرة الدقيقة. بعد ذلك، امسح سطح الحشرة المراد حقنها باستخدام 95% ethanol. تكمن الصعوبة الأكبر في تثبيت الحشرة في الوضع المناسب للحقن، مع التحكم في الإبرة في الوقت ذاته والحرص على عدم ثقب أمعاء الحشرة.علاوة على ذلك، احرص على العمل بسرعة حتى لا تسخن الحشرة وتبدأ في التلوي أثناء إمساكك بها للحقن. احقن 10 µL من معلق الخلايا في الحشرة بزاوية أقل من 45 درجة خلف إحدى الأرجل البطنية الكاذبة. مع توخي الحذر لعدم ثقب الأمعاء، احقن المحتويات مباشرة تحت الطبقة البشرية.بعد حقن كل حشرة بالسلالة الأولى من البكتيريا، قم مرة أخرى بنشر التخفيفات من 10⁻² إلى 10⁻⁶، وهذه المرة في منتصف الطبق. اتركها تتدفق نحو أسفل الطبق. الآن، قم بحضن الأطباق في درجة الحرارة المناسبة، ثم قم بعد المستعمرات لتحديد عدد اللقاح.بعد تكرار عملية التخفيف والزراعة والحقن لكل سلالة من البكتيريا، يتم حقن ثلاث إلى خمس حشرات بمحلول PBS معقم لمجموعة الضبط السالبة. ثم تُحضن جميع الحشرات عند 26 درجة Celsius وفي دورة ضوئية تتكون من 16 ساعة من الضوء وثماني ساعات من الظلام. وأخيرًا، يتم مراقبة بقاء الحشرات على قيد الحياة بمرور الوقت بعد عمليات الحقن؛ إذ غالبًا ما تظهر على الحشرات علامات فقدان الشهية، وإسهال مائي أصفر، أو براز، و/أو فقدان للماء أثناء العدوى قبل الوفاة.يتم تعريف موت الحشرات بأنه غياب الحركة الإرادية عند التحفيز. في هذا الاختبار، حُقنت الحشرات بحوالي 50 وحدة تشكيل مستعمرة إما من النوع البري أو من سلالة طافرة موهنة من Xer Haus NLA نمت حتى مرحلة اللوغاريتم المتوسطة. تمت مراقبة الحشرات لمدة 72 ساعة تقريباً، وسُجلت النسبة المئوية للحشرات المحقونة التي كانت لا تزال على قيد الحياة عند كل نقطة زمنية.في هذه التجربة، أظهرت السلالة الموهنة تأخراً واضحاً في قتل الحشرات، بينما قتلت السلالة البرية جميع اليرقات الست خلال 30 ساعة بعد الحقن، وذلك قبل موت أي من اليرقات المصابة بالسلالة الطافرة. وتعد هذه البيانات متميزة إحصائياً عقب اتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل استخلاص RNA وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد ما إذا كانت البكتيريا قادرة على التلاعب بالاستجابة المناعية للحشرة أم لا.

rearing-injection-manduca-sexta-larvae-to-assess-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

وقد ثبت أن الأجنة الزرد شفاف المضيفين نموذجا مفيدا لتصور ودراسة التفاعلات وظيفيا بين الخلايا المناعية الفطرية ومسببات الأمراض البكتيرية داخل الخلايا،...

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

haemocolic العدوى عن طريق الفم وداخل يرقات العث من الشمع...

والحشرات<em&gt; جاليريا mellonella</em&gt; نموذجا عدوى قوية المعنية بالتحقيق في إمراض البكتيرية

المصدر: بيرنوت، أ.، وآخرون، فك وتصوير سبب وربط خراجات الفطر في أجنة سمك الزرد. ج. فيس. إكسبر. (2015).يوضح هذا الفيديو بروتوكول لعزل وقياس خراج الفطر الفطري عن جنين سمكة الزرد المصاب. يتضمن الإجراء قتل الجنين الرحيم، وتحلل الأنسجة، والتجانس لإطلاق البكتيريا، يليه الطرد المركزي وإعادة التعليق في مخزن خافض للتوتر السطحي. وأخيرا، يتم تخفيف التعليق البكتيري بشكل تسلسلي، وتغطيتها على الأجار المكملة بالمضادات الحيوية، وحضانها لتمكين تكوين المستعمرة وقياسها.

عزل وزراعة البكتيريا من أجنة سمك الزرد لتقييم حمل العدوى

يوضح هذا الفيديو طريقة لإنشاء نموذج عدوى المتفطرة في يرقات عثة الشمع الأكبر ، Galleria mellonella. يتم حقن سلالة مضيئة بيولوجية من المتفطرة بوفيس BCG في هيموليمف اليرقة لإثبات العدوى ، ويتم قياس التلألؤ البيولوجي على فترات محددة مسبقا لدراسة تقدم العدوى.

تقنية لإنشاء نموذج عدوى بكتيرية في يرقات الحشرات

يعرض هذا الفيديو قياس العبء البكتيري في الجسم الحي باستخدام Bacillus Calmette-Guérin و BCG ويرقات الحشرات المصابة باللوكس. تتضمن العملية تجانس اليرقات ، والمعالجة بركيزة لوسيفيراز ، وقياس التلألؤ البيولوجي لتحديد وحدات الضوء النسبية التي ترتبط بالعبء البكتيري.

قياس العبء في الجسم الحي للبكتيريا التي تعبر عن اللوسيفيراز في يرقة الحشرات

هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنموذج إدارة عن طريق الفم استخدام اليرقات Galleria mellonella وكيفية توصيف فعل الاستجابات المناعية الفطرية. باستخدام هذا البروتوكول، سوف تكون قادرة على استخدام ميلونيلا G. التسمين أسلوب الباحثين دون خبرة عملية.

نموذج الإدارة عن طريق الفم Galleria mellonella للاستجابات المناعية الفطرية Study Commensal-Induced

هنا نقدم بروتوكول لحقن بيض الكريكيت، وهي تقنية التي تعمل كطريقة تأسيسية في العديد من التجارب في الكريكيت، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، تدخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجينومي.

حقن Gryllus بيماكولاتوس البيض

تقدم هذه المقالة بروتوكولًا للتحقيق في تأثير بكتيريا الأمعاء الفردية للبعوض ، بما في ذلك عزل وتحديد الميكروبات القابلة للزراعة في منتصف البعوض ، واستنزاف المضادات الحيوية لبكتيريا الأمعاء البعوض ، وإعادة إدخال نوع واحد محدد من البكتيريا.

جرثومية عن طريق الفم الرضاعة مع البعوض المعالجة بالمضادات الحيوية

يصف هذا البروتوكول إجراءات التلقيح المجهري لأجنة Culex quinquefasciatus التي تم تحسينها للعمل مع أدوات تحرير الجينات CRISPR/Cas9. يمكن لهذه التقنية أن تولد بكفاءة طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للوراثة يمكن استخدامها لبناء تقنيات جينية في ناقلات الأمراض هذه غير الم مدروسة.

تقنيات التلقيح الدقيق الجنيني لتولد موتاسيس محدد الموقع الفعال في Culex quinquefasciatus

تم استخدام ذباب ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر البالغة على نطاق واسع ككائنات حية نموذجية للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاستجابات المناعية الفطرية المضادة للميكروبات المضيفة واستراتيجيات العدوى الميكروبية. لتعزيز مرحلة يرقة D. melanogaster كنظام نموذج إضافي أو بديل ، يتم وصف تقنية حقن اليرقات.

ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر بروتوكول حقن اليرقة

تعلم تقييم الفوعة البكتيرية في يرقات الحشرات باستخدام Manduca sexta كنموذج حي. يتضمن التربية من البيض المعقم والحقن المباشر في الجسم، مما يساعد الباحثين على دراسة تفاعلات المضيف مع البكتيريا.

تربية وحقن

استكشف المزيد من الفيديوهات