الفحص وحة لنوروفيروس الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير كمية جزيئات نوروفيروس العصبية المعدية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير تخفيفات عشرية للملقح الفيروسي. وتتمثل الخطوة الثانية في نقل تخفيفات الملقح الفيروسي إلى طبقة أحادية من خلايا raw 2 6 4 0.7 وتحضين الأطباق مع الهز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، يتم سحب اللقاح وتغطيته بنسبة واحد إلى واحد من أجار لويحات C و2XMEM، ثم تُحضن الأطباق لمدة 48 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة. وتتمثل الخطوة النهائية في التغطية بمحلول صبغة الأحمر المتعادل وتحضين الأطباق لمدة تتراوح من ساعة إلى ثلاث ساعات في حاضنة زراعة الأنسجة. وفي النهاية، يتم سحب محلول صبغة الأحمر المتعادل بعناية دون إزالة طبقة الأجار، ثم تُعد اللويحات باستخدام صندوق ضوئي.

يمكن لهذه الطريقة في تقدير كمية الجسيمات الفيروسية المعدية أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال فيروس نوروفيروس، مثل كمية الجسيمات المعدية التي يتم طرحها في البراز، أو الأنسجة التي تدعم الإصابة. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في الحفاظ على خلايا سليمة وحيوية طوال فترة المقايسة. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن مقايسة اللويحات لفيروس نوروفيروس قد تكون صعبة الاستيعاب للأشخاص الذين ليس لديهم خبرة سابقة.

يعتمد الإتمام الناجح لهذا المقايسة على سلسلة تراكمية من الخطوات التي تتطلب كمية مناسبة من الخلايا، ودرجة حرارة صحيحة، وتعاملًا دقيقًا من أجل ملاحظة اللويحات بسهولة. أولاً، افحص الطبقة أحادية الخلايا تحت مجهر ضوئي للتحقق من مورفولوجيا الخلايا؛ حيث يجب أن تظهر غالبية الخلايا بشكل دائري.

لا تسمح للخلايا بالنمو المفرط لأنها عادةً لن تشكل لويحات. لعمل مقايسة اللويحات لفيروس murn neurovirus باستخدام قارورة زراعة أنسجة بمساحة 175 centimeter square من خلايا raw 2 6 4 0.7 التي قاربت على الوصول إلى مرحلة التلاقي، قم بشفط الوسط الغذائي من القارورة وإضافة 10 milliliters من وسط DMEM 10 الطازج إلى الخلايا. بعد ذلك، قم بكشط الخلايا من قاع القارورة باستخدام كاشطة خلايا، واستخدم ماصة 10 milliliter لشفط معلق الخلايا ثم دفعه بقوة ضد قاع القارورة. كرر هذه العملية ثلاث مرات على الأقل لتفكيك أي تجمعات خلوية.

ليناسب قارورة تخزين. يتم سحب 1 إلى 2 مللي لتر من معلق الخلايا ووضعه في قارورة جديدة بمساحة 175 سنتيمتر مربع تحتوي على 33 إلى 34 مللي لتر من DMEM 10. تُحضن القارورة في حضانة زراعة أنسجة عند 37 درجة مئوية و 5% ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام، ثم تُرج مرة أخرى.

بمجرد أن يصبح المكمل جاهزاً لزراعة الأطباق من أجل المقايسة، يتم ضبط كثافة معلق الخلايا لتكون 1 × 10⁶ خلية حية لكل مللي لتر في وسط DMEM 10، ثم يُضاف 2 مل من هذا المعلق إلى كل بئر من بئر لوحة ذات 6 آبار بقطر 3.5 سنتيمتر، وتُغطى اللوحة. بعد ذلك، يتم هز اللوحة يدوياً على الفور 10 مرات لتوزيع الخلايا بشكل متساوٍ في الآبار.

تجنب تحريك الطبق بشكل دائري (swelling) لأن ذلك سيؤدي إلى تكتل الخلايا في مركز البئر. بعد ذلك، ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة لا تقل عن أربع ساعات أو ويفضل طوال الليل للسماح للخلايا بالالتصاق. يمكن الحصول على اللقاح الفيروسي إما من أنسجة متجانسة مصابة بـ MNV أو من عينات براز لفئران مصابة بـ MNV. في حال استخدام عينات الأنسجة، ضع قطعة من النسيج بحجم حبة البازلاء في أنبوب ذو غطاء لولبي سعة 2 mL يحتوي على حبيبات السيليكا المعقمة و 1 mL من DMEM 10 ثم قم بالتجانس هنا.

يُستخدم جهاز المغنطة بسرعة 6,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. وفي حال استخدام عينات برازية، يتم تجنيس ما لا يزيد عن ثلاث حبيبات برازية بنفس الطريقة، ثم تُجمد العينات المجنسة عند درجة حرارة minus 80 °C ويُذاب اللقاح في يوم إجراء مقايسة اللويحات. استخدم ماصة مكررة لتوزيع 1.35 mL من DMEM five في كل بئر من أطباق ذات 24 بئراً، ثم انقل بواسطة الماصة 0.15 mL من لقاح الفيروس الثالث إلى البئر الأول من الطبق.

قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف عن طريق سحب 0.15 milliliters من التخفيف الأول 10⁻¹ ونقله إلى البئر الثاني في الطبق للحصول على تخفيف 10⁻². ثم كرر العملية باستخدام التخفيف من البئر الثاني للوصول إلى تخفيف 10⁻³. لاحظ أنه قد يلزم إجراء المزيد من التخفيفات وصولاً إلى 10⁻⁹ اعتماداً على العينة.

بمجرد تحضير التخفيفات المتسلسلة، قم بتسمية أطباق خلايا 2 64 0.7 ذات الالتحام بنسبة 60 إلى 80% بأسماء العينات والتخفيف المستخدم. بعد ذلك، قم بإزالة كافة الأوساط من أحد الأطباق عن طريق الشفط أو التفريغ، ثم أضف 0.5 milliliters من العينة المخففة إلى بئر واحدة. كرر العملية مع بئر مكررة، ثم انتقل بعد ذلك إلى التخفيف الأدنى التالي.

بمجرد إضافة التخفيفات الثلاثة كافة إلى طبق واحد في مكررات ثنائية، قم بإمالة الطبق ذهاباً وإياباً للتأكد من تغطية جميع الخلايا. كرر الإجراء مع الطبق التالي من الخلايا. وبمجرد معالجة جميع الأطباق، ضعها على جهاز هزاز مضبوط على حوالي 18 ذبذبة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتسخين زجاجة من أغار تم تحضيرها مسبقاً و/أو تعقيمها بجهاز الأوتوكلاف في الميكروويف حتى ينصهر.

بعد ذلك، يتم وضع agar المنصهر في حمام مائي بدرجة حرارة 42 °C للوصول إلى حالة التوازن الحراري. بعد ذلك، اخلط agar المنصهر مع وسط XMEM عقم بتركيز 2X في زجاجة معقمة بنسبة واحد إلى واحد. ضع الزجاجة التي تحتوي على محلول التغطية هذا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C حتى يحين وقت الاستخدام.

في نهاية فترة التحضين التي تستغرق ساعة واحدة، اشفط اللقاح من كل بئر وأضف ببطء 2 mL من محلول التغطية إلى كل بئر، مع التأكد من وضع طرف الماصة مقابل جدار كل بئر. لمنع إزاحة الخلايا، غطِّ الأطباق واترك طبقة التغطية تتصلب لمدة 10 دقائق تقريباً في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل الأطباق إلى حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 48 ساعة.

بعد انتهاء فترة الحضن، افحص الأطباق للتحقق من وجود اللويحات. وفي حال عدم ظهور أي لويحات، أعِد الأطباق إلى الحاضنة ثم افحصها مرة أخرى بعد أربع ساعات. كرر هذه العملية إذا لزم الأمر، على ألا تتجاوز فترة الحضن 72 ساعة.

أولاً، قم بتحضير محلول صبغة الأحمر المتعادل. بعد ذلك، أضف 2 mL من محلول الأحمر المتعادل إلى كل بئر؛ وفي هذا البروتوكول، لا يلزم إزالة سدادة الأروس. قم بحضن الأطباق عند 37 °C لمدة ساعة واحدة.

بعد انقضاء وقت التحضين، افحص الأطباق للتحقق من وجود اللويحات مع إبقاء محلول الأحمر المتعادل في الآبار. إذا لم يظهر أي تلوين، حضّن الأطباق لساعة أخرى ولمدة أقصاها ثلاث ساعات. وبمجرد ظهور اللويحات، اشفط محلول الأحمر المتعادل، مع التأكد من عدم تحريك سدادة agarose، ثم انتقل إلى عد اللويحات.

افحص الأطباق وحدد التخفيف الذي تظهر فيه اللويحات منفصلة بوضوح. ضع الطبق على صندوق ضوئي وقم بعد اللويحات مع وضع نقطة على اللويحات التي تم عدها، وذلك لتجنب تكرار العد.

ثم كرر عملية العد في بئر يحتوي على تخفيف مختلف من الفيروس واحسب عيار الفيروس بوحدات تشكيل اللويحات لكل ملليلتر. وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب، تُظهر هذه الصورة التمثيلية طبقة أحادية قبل العدوى. تم استنبات خلايا raw 2 6 4 0.7 طوال الليل وتصويرها تحت مجهر ضوئي بتكبير 20 مرة.

تظهر هذه الصورة ذات الطبقة الأحادية بعد تكوين اللويحات. صُبغت الخلايا بمحلول neutral red بتركيز 0.01% بعد مرور 48 ساعة من العدوى، وفُحصت تحت مجهر ضوئي بقوة تكبير أربعة مرات. وتشير الأرقام الرومانية one وtwo وthree إلى ثلاث لويحات مرئية.

تُظهر هذه الصورة طبقاً في نهاية بروتوكول مقايسة اللويحات، مع وجود آبار مكررة لثلاث تخفيفات عشرية مُصنفة بأرقام رومانية. يتوافق الرقمان one و four مع تخفيف 10⁻¹، ويتوافق الرقمان two و five مع تخفيف 10⁻²، بينما يتوافق الرقمان three و six مع تخفيف 10⁻³.

يشار إلى العيار الفيروسي للعينة أدناه. أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تغيير رؤوس الماصات بين التخفيفات لتجنب التلوث الخلطي بين العينات، ومعادلة المحاليل لتصل إلى درجة الحرارة الصحيحة، وعدم السماح لجزيئات الخلايا أحادية الطبقة بالجفاف. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء مقايسة اللويحات وتقدير كمية الجزيئات المعدية من فيروس mi neurovirus.

لا تنسَ أنه عند العمل مع Mira Norovirus في كابينة السلامة البيولوجية، يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومآزر المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء، كما يجب التخلص من النفايات بشكل صحيح وفقًا للإرشادات التي وضعتها لجنة السلامة البيولوجية المحلية لديك.