في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس النوم المحدد بمخطط كهربية الدماغ وتركيز اللاكتات أثناء التحفيز البصري الوراثي بإحداثيات التجسيمية الدقيقة. زرع جراحيا الخيوط والقنيات اللازمة لجهاز استشعار اللاكتات وكابل الألياف البصرية. ثم أدخل كابل الألياف الضوئية ومستشعر اللاكتات المعاير مسبقا في قنيات التوجيه في جمجمة.

بعد ذلك ، اضبط شدة تحفيز الضوء الأزرق لتحقيق الاستجابة الفيزيولوجية الكهربية المطلوبة. ثم انتقل إلى جمع بيانات تركيز كهربية الدماغ والعضل الكهربائي واللاكتات بينما يسمح للحيوان بالتصرف تلقائيا و / أو النوم. بالمقارنة مع الطرق الأخرى مثل الدراسات الدوائية لمخطط كهربية الدماغ ، فإن هذا النهج التجريبي له ميزة مراقبة الكيمياء الحيوية للدماغ والفيزيولوجيا الكهربية بينما يتم التلاعب بنشاط الخلايا العصبية في الوقت الفعلي على مقياس زمني أقل من الثانية.

لذا فإن إمكانية الحصول على رؤى جديدة لمجال أبحاث النوم عالية. على سبيل المثال ، يمكن للمرء تحديد المصاحبات الأيضية والفيزيولوجية الكهربية لنوم الموجة البطيئة. يمكن أيضا تطبيق هذا النوع من التجارب في مجالات أخرى من علم الأعصاب ، مثل التعلم والذاكرة أو اللدونة المشبكية أو اضطرابات النوبات.

التقنية الجراحية صعبة من الناحية الفنية. يتطلب قدرا كبيرا من البراعة ، ولكن يمكن تحقيق ذلك من خلال الممارسة. في هذا العرض المرئي ، سأكرر الخطوات الحاسمة لبعض الإجراءات الجراحية المعقدة التي ستكمل الوصف المكتوب.

بمجرد أن يتعافى من الجراحة ، يتمثل التحدي في إدخال مستشعر اللاكتات وكابل الألياف الضوئية بشكل صحيح. سنوضح أنا وجوناثان كيفية استخدام يد حازمة عند تقييد لإدخال هاتين القطعتين الحساستين من المعدات. أخيرا ، سنوضح كيفية تحسين استجابة مخطط كهربية الدماغ عن طريق ضبط شدة الحافز في الوقت الفعلي.

في هذه التجربة ، استخدم الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن القناة الكاتيونية الحساسة للضوء الأزرق. تعتمد القناة في قسمين في الخلايا العصبية القشرية الدماغية. قم أولا بتخدير الفأر باستخدام 5٪ من الفلور ، 95٪ أكسجين للتحريض مع الحفاظ على التخدير بنسبة 3٪ من الفلور ، 97٪ أكسجين.

قم بعمل شق وسطي في الجزء العلوي من الجمجمة من بين العينين إلى الجزء الخلفي من الجمجمة. نظف الجمجمة ببيروكسيد الهيدروجين والمحلول الملحي المعقم. حدد موقع B و Lambda وقم بتمييزه لتحديد الإحداثيات التجسيمية لتكوينات التحفيز البصري الوراثي للقطب الكهربائي ، وفتحات المسامير الأولية مع مثقاب أسنان عالي السرعة مع لقمة البر الكروية 0.5 ملم متبوعة ببت الكرة 0.7 ملليمتر.

أدخل مسامير كيلو جرام القطب الكهربائي في الفتحات باستخدام مفك براغي يدوي مشقوق. قم بدفعهم في ما يقرب من أربع إلى خمس دورات للحصول على العمق المطلوب. امسك قنيات التوجيه في مكانها باستخدام قنية تجسيمية ، ثم قم بتثبيتها على الجمجمة والمثبتات بالأسمنت الأكريليكي للحفاظ على المباح ، يجب أن تحتوي كل قنية إرشادية على قنية وهمية أو نمط من وقت الجراحة إلى وقت التجريب.

بمجرد وضع مخطط كهربية الدماغ والقنيات التوجيهية في الجمجمة ، اربطها معا بطبقة رقيقة من الأسمنت الأكريليكي للأسنان. بعد مجموعات الأسمنت ، ضع الموصل البلاستيكي فوق كومة الأسمنت المجففة المباعة في نهايات الأسلاك المنبعثة من مخطط كهربية الدماغ يؤدي إلى جهات الاتصال الموجودة على الموصل البلاستيكي في حالة يؤدي السلك إلى الأسمنت. ثم ارسم أسلاك مخطط كهربية العضل عبر عضلات النواة عن طريق تحريكها في ماسورة إبرة قياس 21.

مثقوبة من خلال العضلات ، عقدة جراح مزدوجة ، خياطة من النايلون بخمسة صفر حول هذه الأسلاك بعيدة تماما عن المكان الذي تخرج فيه من خياطة العضلات معا ، والجلد الذي تم سحبه للوصول إلى الأنسجة العضلية بعقدة جراح واحدة متقطعة باستخدام قطع عكسي P ثلاث إبرة وخمسة خياطة نايلون صفر. بمجرد برمجة وحدة التحفيز mc ، قم بتشغيلها كمولد إشارة مستقل كإشارة تشغيل وإيقاف ثنائية بخمسة فولت. قم بتوصيل وحدة التحفيز mc بوحدة الطاقة التي تدعم TTL لليزر باستخدام موصلات BNC.

قم بتوصيل وحدة طاقة الليزر بالليزر عبر كابل شريط. قم أيضا بتوصيل الليزر بموصل FC الذكر على كابل تصحيح الألياف البصرية الأصلي. قم بتوصيل كابل الألياف البصرية الأصلي بالمفصل الدوار.

المفصل الدوار للألياف البصرية كمبدل. عندما يتحرك حول قفصه ، يدور المفصل الدوار لمنع كسر كابلات الألياف الضوئية بسبب عزم الدوران الدوراني. مع روابط الكابلات البلاستيكية ، قم بلصق العاكس على حامل معدني يوضع فوق القفص الأسطواني الذي يوجد فيه.

قم بتقييد الماوس باستخدام يد واحدة لتثبيت الماوس تحت راحة اليد المقعرة. قم بتوجيه الرأس بين الإصبع الأوسط والسبابة للمجري. الآن قم بمسح قنية التوجيه من الحطام والحطام باستخدام إبرة معقمة قياس 25.

ثم أدخل كابل الألياف الضوئية يدويا واربطه بدليل الألياف البصرية قنية بغطاء لولبي ملولب. التحكم في عمق إدخال كابل الألياف الضوئية في الدماغ عن طريق عقدة خياطة مربوطة على كابل الألياف الضوئية على مسافة ثابتة من الطرف المشقوق المسطح. يتم مساوئ المستشعر في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ويتعرض لثلاثة تركيزات من لاكتات L بطريقة تدريجية.

وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة ، أدخل المستشعر المعاير مسبقا في قنية توجيه اللاكتات المثبتة على الجمجمة بطريقة مماثلة لإجراء إدخال كابل الألياف البصرية. قم بتوصيل مستشعر اللاكتات بمكبر الصوت المسبق للمستشعر الحيوي الذروة 8 ، 400 مع موصلات التوصيل ثنائية القطب. ثم قم بتوصيل مكبر الصوت المسبق هذا بموصل ثمانية سنون على حامل الرأس المزروع

قبل جمع البيانات ، استخدم مقبض التحكم في شدة الليزر لضبط شدة الحافز البصري الوراثي. ستختلف سعة استجابة مخطط كهربية الدماغ باختلاف بسبب عوامل لم تتم دراستها بشكل منهجي. لذلك من الضروري ضبط شدة الحافز البصري الوراثي والتحقق من أن استجابة مخطط كهربية الدماغ كافية عند تحقيق الاستجابة المطلوبة.

اجمع البيانات باستخدام نظام Pinnacle 8 ، 400 مع الدرجة العصبية. تصنف واجهة SEIA حالات السكون عن طريق الفحص البصري لعملية بيانات EEG و EMG. البيانات في عشر فترات ثوان مثل حركة العين غير السريعة للاستيقاظ أو النوم أو نوم حركة العين السريعة بناء على مخطط كهربية الدماغ ومخطط كهربية العضل.

يظهر تكوين التحفيز البصري الوراثي للمستشعر الحيوي أقطاب مخطط كهربية الدماغ المزروعة جراحيا ، ومستشعر اللاكتات ، والقنية للتحفيز البصري الوراثي. في حالة عدم وجود تحفيز بصري ، خضع هذا الفأر لنوم تلقائي. تم مراقبة انتقالات حالة الاستيقاظ أثناء مراقبة تركيز اللاكتات الدماغية والاستيقاظ المستمر والنوعين الفرعيين من النوم.

يتم تحديد حركة العين السريعة وحركة العين غير السريعة بناء على مخطط كهربية الدماغ ومخطط كهربية العضل. ومن المثير للاهتمام ، أن تيار المستشعر الحيوي للاكتات يرتفع كدالة لمخطط كهربية الدماغ منخفض السعة ، وينخفض كدالة لمخطط كهربية الدماغ عالي السعة. تستجيب كلتا قناتي مخطط كهربية الدماغ للمنبهات البصرية الوراثية التي يتم تسليمها في القشرة الأمامية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زرع فأر جراحيا للتلاعب البصري الوراثي المتزامن وقياس مخطط كهربية الدماغ ومخطط كهربية العضل وتركيز اللاكتات في الدماغ. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية الجراحية بشكل صحيح في 90 إلى 120 دقيقة. تذكر أن تراقب باستمرار تنفس كمقياس لعمق التخدير.

إذا كان يتنفس بشكل أقل من مرة كل أربع إلى خمس ثوان ، فقد يكون التخدير عميقا جدا. إذا كان يتنفس بشكل متكرر أكثر من مرة كل ثانيتين ، فقد يكون التخدير خفيفا جدا. تذكر اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة عند استخدام عامل مخدر الغاز هوالفلور.

تأكد من التهوية الكافية في الجناح الجراحي لحماية شبكية العين من الليزر المستخدم للتحفيز البصري الوراثي. إما أن ترتدي نظارات واقية أو تحيط بالحيوان في خزانة مقاومة للضوء. سترغب في التدرب على زرع المستشعر الحيوي اللاكتات وكابل الألياف الضوئية في ماوس مستيقظ تماما.

الفئران لا تمتثل لهذه الإجراءات ويجب شل حركتها. ومع ذلك ، لا يمكن أن يكون ضبط النفس قويا لدرجة إصابة أو منع التنفس.