بسرعة وكفاءة توليد الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في تنسيق اللوحة Multititre

الهدف العام من التجربة التالية هو التفريق بين الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أو H PSCs إلى خلايا عصبية باستخدام تنسيق لوحة متعددة العيارات. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد وطلاء معلق خلية واحدة من H PSCs في قاع V 96. ألواح البئر لتشكيل أجسام الجنين أو EBS بين عشية وضحاها.

بعد ذلك ، يتم نقل EBS إلى ألواح تعلق منخفضة للغاية على شكل حرف U تحتوي على وسط تمايز للحث على تكوين الأديم الظاهر العصبي. بعد ذلك ، يتم طلاء EBS على أطباق مغلفة ب matrigel لتعزيز نمو الخلايا العصبية. يمكن الحصول على النتائج التي تظهر وجود علامات عصبية نموذجية في اليوم الثامن عن طريق التألق المناعي.

ما تكون بروتوكولات التلوين للتمييز بين الخلايا الجذعية البشرية القوية إلى خلايا عصبية معقدة ومملة. عن طريق الصدفة إلى حد ما. لقد صادفنا إجراء بسيطا للغاية لصنع الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية البشرية القوية مسبقا.

من وجهة نظر فنية ، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية هي أنها سهلة التنفيذ وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. في الوقت نفسه ، سيكون تقديم الإجراء الدكتور MI Z من المختبر. إعداد وسيط تكوين EB ووسيط التمايز كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

قم بزراعة h PSCs في ظل ظروف خالية من التغذية مثل وسط مكيف للميثامفيتامين على ألواح مطلية ب matrigel ، أو باستخدام أنظمة استزراع محددة كيميائيا في ظل ظروف نمو نشطة دون التقاء. يؤدي استخدام مجهر استريو بطرف ماصة بلاستيكي معقم إلى إزالة المستعمرات المتمايزة تلقائيا ميكانيكيا. اغسل المستعمرات المتبقية غير المتمايزة باستخدام PBS واستخدم Accutane الذي يحتوي على مثبط صخور x واحد لهضم الخلايا المفردة.

قم بتحبيير الخلايا المفردة عن طريق الطرد المركزي عند 200 جم لمدة دقيقتين وتعليق Resus في حجم صغير من وسط تكوين EB. استخدم مقياس الخلوي الدموي لتحديد عيار الخلية. أضف خلايا إضافية إلى وسط تكوين EB المتبقي للوصول إلى عيار يتراوح بين 40،000 و 80،000 خلية لكل مليلتر.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 100 ميكرولتر لكل بئر إلى صفيحة سفلية بجهد 96 فولت، مما ينتج عنه 4,000 إلى 8,000 خلية لكل خلية. حسنا. قم بتدوير اللوحة في جهاز طرد مركزي لأعلى عند 400 جم لمدة دقيقة واحدة لجمع جميع الخلايا في قاع الآبار. انقل الخلايا إلى حاضنة واسمح ل EBS بالتشكل بين عشية وضحاها في اليوم التالي تحت المجهر الاستريو.

اجمع EBS وانقله بحجم صغير إلى طبق بكتيري يبلغ طوله 3.5 سم يحتوي على ملليلترين من التمايز. متوسط. اغسل الخلايا عن طريق تدوير الطبق برفق. أضف 100 ميكرولتر من وسط التمايز إلى كل بئر من مرفق منخفض للغاية.

أسفل 96 لوحة بئر تحت مجهر ستيريو. انقل EBS بكميات صغيرة من طبق الغسيل إلى آبار 96 U. احتضان EBS لمدة أربعة أيام للسماح بتكوين الأديم الظاهر العصبي في اليوم الرابع.

اغسل الخلايا في وسط التمايز وقم بزرعها واحدة تلو الأخرى في آبار صفيحة متعددة العيار المطلية ب matrigel ، مثل صفيحة 12 بئر. يجب توزيع الخلايا بالتساوي داخل الآبار للسماح بنمو الخلايا العصبية دون إزعاج. اسمح ل EBS بالالتصاق بشكل غير محكم ب matrigel لمدة 10 دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة.

ثم انقل اللوحة بعناية إلى الحاضنة. ستنمو الخلايا العصبية من EBS المطلي بطريقة شعاعية خلال الأيام الأربعة المقبلة. أظهرنا سابقا أنه بما يتماشى مع العديد من الأنواع الأخرى ، يمكن إنشاء EBS من H PSCs ببساطة عن طريق إعادة الطلاء ، والمجاميع عند التقسيم الروتيني ل H HPCs إلى أطباق منخفضة المرفق.

ينتج عن هذا عادة توزيع واسع لأحجام الخلايا. مشكلة أخرى هي أن EBS المحفوظة في التعليق تميل إلى التجمع مع بعضها البعض مما يؤدي إلى عدم تجانس أكبر في الحجم للتحايل على H PSCs المفردة التي تم الترافع عنها في آبار منخفضة الارتباط ، مما أدى إلى عدم تكوين EB وموت الخلايا. ومع ذلك ، فإن الجمع بين جزيء بقاء الخلية ، Y 2 7 6 3 2 مع كحول البولي فينيل ، والذي ثبت أنه يعزز تكوين EB من HSCs ، سمح ل EBS بالتكوين من معلقات HESC أحادية الخلية بين عشية وضحاها.

بشكل ملائم ، يمكن التحكم بإحكام في أحجام EB في تنسيق اللوحة متعددة العيارات هذا عن طريق جلوس أعداد مختلفة من الخلايا لكل بئر. على عكس استخدام التقنيات التقليدية ، بعد نقل EBS إلى لوحة 96 U منخفضة للغاية ، تم تحفيز تكوين الأديم الظاهر العصبي باستخدام كوكتيل جزيئي صغير يتكون من F-G-F-E-R-K-T-G و TGF beta SMA two ومثبطات BP SMA واحدة ، والتي سمحت بعد ذلك للخلايا بالطلاء على ماتريجيل لتكوين الخلايا العصبية. أدى بدء تكوين EB من حوالي 8،000 خلية إلى أفضل قدرة على التمايز العصبي ، والتي تتميز بنمو الخلايا العصبية الواضحة من ebs المطلي.

انخفاض مراكز EB النخرية بعد الطلاء والتعبير العالي عن العلامات العصبية الحسية وعمومية مثل B و rrn three A و beta three tubulin. يبدو أن كفاءات التمايز العصبي الإجمالية قابلة للمقارنة مع الإجراء الأصلي ، والذي ينطبق على كل من HSCs و HI PSCs حتى الآن. تم اختبار ثلاثة خطوط HPSC مستقلة ، HES وكذلك خلايا HIPS بنجاح في إجراء متعدد الآبار ، في حين لا يمكن استبعاد التباين المعتمد على خط الخلية وكفاءات التمايز بشكل عام.

يوضح هذا الشكل أربع خلايا من الأديم العصبي الظاهر منفصلة في يوم واحد تم طلاؤها كخلايا مفردة وتم تمايزها بنجاح بكفاءة 60٪ تقريبا يتطلب التعامل مع EBS في منصة العيار المتعدد القليل من التدريب في البداية ، ولكن بعد مرور بعض الوقت ، سترى أنه سهل للغاية.