تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع الخلايا التي تم تبديلها بالصور في جنين أسماك الحمار الوحشي الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تضمين الجنين أولا ، والتعبير عن صورة خاصة بالأنسجة ، والبروتين الفلوري القابل للتحويل في درجة حرارة انصهار منخفضة. بعد ذلك ، يتم تحويل البروتين داخل المنطقة محل الاهتمام بالكامل.

ثم تتم إزالة الجنين بعناية من الأروس وحفظه في ماء البيض عند 28.5 درجة مئوية حتى مراحل لاحقة. أخيرا ، يتم تضمين الجنين المحول بالصورة مرة أخرى في درجة حرارة انصهار منخفضة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر أنه يمكن اكتشاف الخلايا المحولة بالصور بدقة في مراحل لاحقة بسبب الوجود المستقر للبروتين المحول بالصورة من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.

لذلك نعتقد أن الطريقة التي سنقدمها اليوم ستكون مفيدة جدا في سياق الخلية والبيولوجيا التنموية. لذلك نعتقد أن استخدام هذه المنهجية في سياق هجرة الخلايا وديناميكيات الأنسجة وسلوكيات الخلايا الأخرى سيكون مفيدا للغاية. سيتم توضيح الإجراء فيرونيكا لومباردو ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري بعد عبور الزرد المعدل وراثيا ، والتعبير عن بروتين فلوري قابل للتحويل بالصور.

اختر ألمع الأجنة المتماثلة اللواقح وقم بزراعتها عند 28.5 درجة مئوية عندما تصل إلى المرحلة المطلوبة. استخدم الملقط لتغطيتها في وعاء زجاجي بماء البيض لتخدير الأجنة. استخدم ماصة زجاجية أو طرف ماصة مقطوع لنقلها واحدة تلو الأخرى إلى trica.

انقل جنينا مخدرا إلى غطاء طبق مزرعة وحافظ على الجنين ضمن أصغر حجم ممكن من الوسط. انقل الجنين إلى aros عن طريق ماصته بدرجة حرارة انصهار منخفضة بنسبة 1٪ مع trica عند 30 درجة مئوية ، وضعه في طبق مزرعة ذو قاع زجاجي. استخدم طرفا بلاستيكيا أملسا لتوجيه الجنين عندما يتبلمر agros.

قم بتغطيته بمحلول Trica على مجهر متحد البؤر مقلوب مزود بمصادر ليزر 405 و 488 و 561 نانومتر وهدف 20 ×. استخدم الليزر 488 و 561 نانومتر لإنشاء كومة Z للهيكل الكامل للعينة ، والتي تتضمن منطقة الاهتمام. حدد أداة السلسلة الزمنية وقم بتعيينها لدورتين بدون فاصل زمني ، واحدة لتحويل الصور المسبقة والأخرى لتحويل الصور اللاحقة.

حدد أداة المنطقة وحدد منطقة اهتمام واحدة أو أكثر لتحويل الصور. بعد ذلك ، حدد أداة التبييض واضبطها لبدء التبييض بعد الفحص. واحد من اثنين مستخدمين هنا هو ليزر 30 مللي واط 405 نانومتر.

تم تحسينه بعناية للحصول على الحد الأدنى من ضوء الليزر اللازم لتحويل الصور بالكامل ، والذي يتم تحقيقه عن طريق تغيير شدة ضوء الليزر وتكرارات المسح الضوئي للمنطقة محل الاهتمام وسرعة المسح. امسح العينة ضوئيا باستخدام ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر لتصور أي لون أخضر متبقي والصورة المحولة باللون الأحمر لبروتين الفلورسنت القابل للتحويل للصور. بعد تحويل الصورة ، تخلص من المحلول وباستخدام إبرة أو طرف بلاستيكي أملس ، قم بإزالة الجنين بعناية من agros.

الحفاظ على الجنين في ماء البيض في الظلام عند 28.5 درجة مئوية حتى مرحلة النمو المطلوبة. قم بتضمين الجنين مرة ثانية ، ثم قم بإنشاء Zack للعينة ، بما في ذلك منطقة الاهتمام ، مرة أخرى باستخدام ليزر 488 و 561 نانومتر. نظرا لأن هذا البروتوكول لا يؤثر على التطور الطبيعي ، فمن الممكن ملاحظة الجنين المحول بالصور في مراحل لاحقة.

في ما يلي مثال على اختبار تحويل الصور. تم تتبع الخلايا البطانية أثناء تطور أسماك الزرد من 48 إلى 72 ساعة بعد الإخصاب باستخدام خط مراسل معدل وراثيا يعبر عن ركلة G داخل النوى البطانية كما هو موضح هنا قبل تحويل الصورة تم التعبير عن ركلة G داخل الأنسجة البطانية ولم يكن من الممكن اكتشافها إلا على أنها مضان أخضر باستخدام مسح التحكم بليزر الأرجون 488 نانومتر باستخدام ليزر 561 نانومتر للمضان الأحمر. لم يكتشف أي صورة تم تحويلها إلى ركلة GR قبل تحويل الصورة.

بعد ذلك ، تم تحويل المنطقة محل الاهتمام بالكامل باستخدام ليزر 405 نانومتر بكثافة 10٪ ، و 20 تكرارا وتم مسح الأوعية الرئيسية مرة أخرى باستخدام ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر. في هذه اللوحة ، تحولت الركلة الخضراء G تماما إلى اللون الأحمر داخل المنطقة ذات الاهتمام لتتبع الخلايا البطانية المحولة للصورة في مراحل لاحقة. لوحظ الجنين بعد 24 ساعة من تحويل الصورة ، أي بعد حوالي 72 ساعة من الإخصاب داخل الأنسجة البطانية الناشئة عن منطقة الاهتمام المحولة بالصورة.

لوحظ كل من بروتينات الركلة G غير المحولة والصور بسبب استقرار الصورة الفلورية الحمراء المحولة ركلة g ، وتوليف ركلة G الخضراء الجديدة غير المحولة بعد تطويرها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء التنموي لاستكشاف بيولوجيا الخلية وإعادة تشكيل الأنسجة في العديد من الأسماك.