قياس كمية الاستجابة المناعية والنوم في ذبابة الفاكهة

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم النوم ووظيفة المناعة في ذبابة الفاكهة. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق تسجيل النشاط الحركي للذباب المصاب لقياس النوم والبقاء على قيد الحياة كخطوة ثانية بعد تجانس الذباب المصاب وتخفيفه وانتشاره على ألواح أجار LB. يشير عدد وحدات تكوين المستعمرات التي تنمو إلى قدرة الذباب على التخلص من العدوى.

بعد ذلك ، يضاف الذباب المصاب الذي يعبر عن جين معدل يحتوي على NF kappa b luciferase المراسل إلى صفيحة 96 بئر تحتوي على لوسيفيريان ، ركيزة لوسيفيراز. يشير القياس في الوقت الحقيقي لكاميرا ب لوسيفيراز إلى تنشيط مسار إشارات NF kappa B أثناء العدوى تماما نتيجة البقاء على قيد الحياة في النوم. التصفية البكتيرية ونشاط مراسل NF KB هي قياسات توفر نظرة ثاقبة ميكانيكية للارتباط الجزيئي بين وظيفة المناعة والسلوك.

بشكل عام ، الأفراد الجدد على هذه الطريقة أو يكافحون لأن الأمر يستغرق وقتا وممارسة لتعلم كيفية إصابة الذباب يدويا بالاتساق. الميزة الرئيسية لتقنية Lucifer المبلغ عنها على الطرق الحالية مثل QPCR هي أنه يمكن قياس نشاط NF Kappa B بشكل مستمر في الوقت الفعلي في الحياة. يبدأ الذباب باحتضان ثقافات ذبابة الفاكهة التي نظمت التلاميذ المتأخر لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام ، حتى يتكيف البالغون مع الظروف البيئية.

هنا يتم وضع الذباب تحت ضوء مستمر للقضاء على تأثير الساعة البيولوجية على الاستجابة المناعية والسلوك. بعد ذلك ، قم بالتحميل من يوم إلى أربعة أيام في النشاط. يسجل المراقبون نشاطهم لمدة ثلاثة أيام على الأقل قبل الإصابة بيوم واحد قبل العدوى المجدولة.

اختر مستعمرة SIA واحدة بطرف ماصة معقمة واغمر الطرف في أنبوب استزراع يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط LB للتحقق من تقنية التعقيم. لا تنس أن تصنع ثقافة وهمية للتحكم بدون بكتيريا. تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها حتى تصل إلى مرحلة النمو الأسي في اليوم التالي.

قم بقياس امتصاص المزرعة عند 600 نانومتر. قم بتضمين طبيب بيطري Q ثان كفارغ. يكون جاهزا عندما يكون التركيز بين 0.5 إلى وحدة امتصاص واحدة ثقافة فرعية ، أو قم بتمديد وقت الثقافة حسب الحاجة.

الآن قم بإعداد المحلول البكتيري لإصابة الذباب. تمييع البكتيريا مع PBS إلى امتصاص متوقع يبلغ 0.1 عند 600 نانومتر. ثم أضف ألوان الطعام للتحكم في الحقن.

استبدل البكتيريا بوسط LB. قم بتخزين كلا الحلين على الثلج. بعد ذلك ، باستخدام مجتذب ماصة صغيرة ، اصنع إبر حقن بطرف رفيع تحت مجهر تشريح.

استخدم ملقطا دقيقا لقطع طرف كل إبرة بحيث تكون الفتحة كبيرة بما يكفي لملء سائل الحقن باستخدام الشفط ، ولكنها أيضا صغيرة بما يكفي لتقليل الضرر الذي يلحق بالذبابة. قم بتوصيل إبرة زجاجية بحقنة بلاستيكية بطول ثلاثة سم مكعب باستخدام المحقنة. يتم التحكم في تدفق وسط الحقن يدويا.

تجنب تلويث الأنابيب المطاطية بسائل الحقن حيث يتم استخدام جهاز الحقنة لكل من الحقن المعدي والسيطرة. تحقق من تدفق وسط الحقن باستخدام منديل Kim Wid. هناك تفاصيلان مهمتان للحقن الناجحة هما استخدام الحجم الأمثل للإبرة والختم الآمن بين الإبرة والمحقنة.

بمجرد أن يتم تجهيز نظام الحقن بالكامل ، قم بتخدير الذباب باستخدام الحد الأدنى من تدفق ثاني أكسيد الكربون ، واستمر بسرعة حتى لا يتم تخدير الذباب لمدة تزيد عن خمس دقائق. الآن حقن الذباب عن طريق دس الإبرة الزجاجية في المنطقة فوق الانحراف في الصدر الظهري. يتم التحقق من مرور وسط الحقن في الذبابة من خلال تلوين الطعام ، والذي يمكن رؤيته مع انتشار المحلول المحقون.

قبل البدء ، تأكد من أن جميع المواد المستخدمة في هذا الإجراء قد تم تعقيمها أيضا قبل يوم واحد على الأقل. تحضير أطباق بتري 10 سم مع وسط أجار LV. في يوم التجربة ، قم بالتخدير ووضع الذباب في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر.

قم بإعداد مجموعتين على الأقل من 10 ذباب لكل حالة تجريبية. قم أيضا بإعداد مجموعة تحكم من الذباب بدون عدوى ، خاصة عند استخدام سلالة بكتيرية بدون مقاومة للمضادات الحيوية. قم بتخزين جميع الأنابيب المحملة على الثلج.

بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من وسط LB إلى كل أنبوب محمل بالذبابة. قم بتجانس الذباب باستخدام قشرة صغيرة وافعل ذلك بالقرب من اللهب لمنع التلوث. الآن باستخدام أطراف الماصة المقطوعة، قم بتخفيف التجانس التسلسلي بعوامل 10 بأحجام 200 ميكرولتر.

إذا تم إجراء التجانس مباشرة بعد الإصابة ب sia, جعل dilu ما يصل إلى واحد إلى 1000, ولكن لمدة 24 ساعة, بعد العدوى متجانسة, جعل ما يصل إلى واحد إلى 100,000. البذرة التالية ، أكبر اثنين من الألواح على ألواح 10 سم باستخدام كرات زجاجية لضمان توزيع متساو ، تحتضن الألواح بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، احسب عدد المستعمرات على اللوحة عن طريق الملاحظة المباشرة أو عبر برنامج عد المستعمرات.

ثم احسب عدد وحدات تشكيل المستعمرة لكل ذبابة. يستخدم هذا الاختبار الذباب المعدل وراثيا الذي يحمل مراسل كابا ب لوسيفيراز في الوقت المناسب. يتطلب الاختبار أيضا بكتيريا مستنبتة مثل SCIA معدة للحقن كما هو موضح في القسم السابق.

اضبط الذباب على ظروف الإضاءة التجريبية. في هذا المثال ، يتم وضع ذباب كابا ب لوسيفيراز البالغ من العمر من يوم إلى أربعة أيام في قوارير تحتوي على 5٪ سكروز ، 2٪ أجار وسط طعام ، ويوضع في ضوء مستمر لمدة يومين. الآن قم بإعداد صفيحة دقيقة 96 جيدا للذباب.

املأ كل بئر بطبقتين من الطعام. متوسط أولا ، أضف 300 ميكرولتر من محلول أجار 5٪ ، 2٪ أجار لكل منهما. قم بتغطية اللوحة جيدا بقطعة قماش شبكية ناعمة واترك اللوحة تجف تماما لمدة تصل إلى ساعة.

بعد ذلك ، أضف طبقة علوية سعة 50 ميكرولتر إلى كل بئر تحتوي على 5٪ سكروز و 1٪ أجار و مللي مولار لوسيفر. نظرا لأن لوسيفر حساس للضوء ، اترك اللوحة تجف في الظلام والمضي قدما. قلل من تعرض اللوحة للضوء.

بمجرد أن يبرد الأجار ، قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف. ثم باستخدام إبرة رفيعة ، قم بثقب الفيلم مرتين فوق كل بئر. تسمح هذه الثقوب بتبادل الهواء والتخدير الغازي.

بعد ذلك ، لتسهيل تحميل الذباب ، استخدم شفرة حادة وحافة مستقيمة لإدخال قطع بين كل عمود. قم بتخدير الذباب بثاني أكسيد الكربون وتحميله واحدا تلو الآخر لكل عمود بئر. إذا علقت الذبابة في الفيلم ، فامنحها فرصة لتحرير نفسها قبل التدخل.

أعد لوحة البئر الصغيرة إلى الحاضنة تحت ضوء مستمر لمدة ثماني إلى 24 ساعة. لتخدير الذباب المرتبط جيدا، استخدم طرف ماصة صغيرة متصلة بخط ثاني أكسيد الكربون منخفض الضغط. تأكد من أن الغاز في ضغط منخفض بشكل غير ضار وضع طرف الماصة الدقيقة مباشرة فوق فتحات التهوية لتخدير الذبابة في مجموعات من ثمانية بشكل فردي.

انقل كل ذبابة إلى وسادة CO2 وقم بإصابتها بالبكتيريا كما كان من قبل. ثم أعد كل ذبابة إلى بئرها الأصلي وأعد إغلاق الصفيحة الدقيقة. قم بقياس اللمعان في كل ذبابة باستخدام مقياس إضاءة موجود في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها وفقا لجدول إضاءة محدد.

قم بتحميل الألواح في كاسيت التكديس ، وتأكد من تكديس الألواح التي تحتوي على الذباب بين الألواح الفارغة الشفافة. قم ببرمجة مقياس الإضاءة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة وجمع القراءات كل ساعة لمدة لا تقل عن 24 ساعة. في هذا المثال ، تمت برمجة أجهزة الكشف لقراءة كل بئر لمدة 10 ثوان.

بمجرد الانتهاء ، قم بتصدير ملفات البيانات إلى جدول بيانات وقم بإجراء تحليل قياسي يوضح النتائج. يمكن تحليل مثال البيانات. بلغ متوسط الخصومات في الثانية من ثلاث قراءات لكل بئر.

كانتون S نوع البري الذباب والاستمتاع. تم تحميل E 20 ذبابا متحورا تفتقر إلى جين NF kappa B في مراقبين للنشاط في ضوء مستمر ومصابة ب sia. في هذا المثال ، عززت العدوى النوم.

كان من الواضح أن طفرات Relish E 20 شهدت نوما أقل من كانتون s. التحكم في الذباب بعد الإصابة. تمشيا مع النتائج السابقة ، استسلمت طفرات E 20 اللذيذة أيضا بسرعة للعدوى مقارنة بالذباب البري.

نجا معظم الذباب من حقن التحكم المعقم مما يشير إلى أن الذباب استسلم للعدوى وليس للإصابة بسبب الحقن. نظرا لأن طفرات المذاق ماتت بسرعة كبيرة ، فقد تم استخدام ذباب كانتون فقط لإثبات الحمل البكتيري بعد الإصابة. استمرت سيا في التكاثر في الذبابة بعد 24 ساعة من الإصابة.

أظهر نشاط مراسل لوسيفر تباينا كبيرا بين الذباب الفردي وبين نجاح نقاط البيانات. على الرغم من أن الإشارة مشتقة من جميع الأنسجة داخل الذبابة ، إلا أنه من غير المتوقع أن يصدر كل نسيج نفس القدر من الإشارة وستختلف رؤية الأنسجة للكاشف مع تحرك الذبابة. في هذا المثال ، أصيب الذباب بالعدوى ومقارنته بمجموعة تحكم تم التعامل معها.

تم استبعاد الذباب الذي مات من التحليل عبر مجموعة من الذباب. يرتفع نشاط مراسل Kappa b Luciferase بشكل مطرد بعد الإصابة. كما ارتفع نشاط مراسل Kappa b Luciferase بشكل مطرد بعد الإصابة المعقمة.

كانت ذروة النشاط حوالي 12 ساعة لكل من ما بعد الإصابة وما بعد الإصابة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد وظيفة المناعة والنوم في SSO بعد الإصابة. يمكننا قياس النوم والبقاء على قيد الحياة والوقت والتصفية البكتيرية والنشاط في الوقت الفعلي لمراسل نسخ un copy.