حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء عمليات حذف لجين واحد على نطاق الجينوم في بكتيريا streptococcus sanguine باستخدام تقنية PCR عالية الإنتاجية. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال الحصول على ثلاثة نواتج تضخيم عن طريق تضخيم PCR عالي الإنتاجية، بما في ذلك جين المقاومة للمضادات الحيوية، بالإضافة إلى تسلسلات DNA الموجودة في الاتجاهين العلوي والسفلي للجين المستهدف. وتتمثل الخطوة الثانية في الحصول على ناتج PCR تضخيم معاد التركيب خطي باستخدام نواتج تضخيم PCR الثلاثة كقوالب.

بعد ذلك، يتم تحضير خلايا s sanguine الكفؤة. والخطوة النهائية هي تحويل ناتج تضخيم PCR المؤتلف الخطي إلى خلايا s sanguineous كفؤة. وفي النهاية، يُستخدم تضخيم PCR للمستعمرة A وتسلسل DNA للتحقق من الطفرات الصحيحة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى المستنفذة، مثل تعطيل الجينات باستخدام البلازميد الانتحاري، في قدرة هذه الطريقة على إنشاء طفرات حذف على نطاق الجينوم بالكامل مباشرة باستخدام الإنتاجية العالية. يمكن تصميم وتخليق بادئات PCR كما هو موضح في البروتوكول المكتوب باستخدام نصوص برمجية داخلية تعتمد على تسلسل جينوم streptococcus sanguineous SK 36. تم تصميم ثلاث مجموعات من البادئات لتضخيم تسلسل طوله 1 kb من المنطقة الواقعة upstream للجين المستهدف، والترميز المشفر لبروتين A PHA three gene ENC، وبروتين مقاومة الكاناميسين، وتسلسل طوله 1 kb من المنطقة الواقعة downstream للجين المستهدف.

بادئات متخصصة للجين. تم تصميم البادئتين R one و F three بناءً على تسلسلات الطرف 5' والطرف 3' للجين المستهدف لتضخيم منطقة 1 kilobase في الاتجاه العلوي أو السفلي لجينات s sanguine المستهدفة ذات الإنتاجية العالية. أولاً، قم بتحضير خليط تفاعل PCR على الثلج في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.

راجع النص لمعرفة مكونات خليط PCR الذي يحتوي على DNA جينومي من s sanguineous، ثم انقل 23 µL من الخليط إلى كل بئر في صفيحة PCR ذات 96 بئراً باستخدام ماصة متعددة القنوات. وللحصول على التسلسل العلوي للجين المستهدف، انقل 1 µL من كل من البادئات F1 و R1 من صفائح البادئات التشغيلية بتركيز 10 µM إلى صفيحة PCR باستخدام الماصة متعددة القنوات. كرر العملية نفسها مع البادئات F3 و R3 لتضخيم التسلسل السفلي للجين المستهدف. أغلق صفيحة PCR بإحكام وأجرِ عملية التضخيم عند 94 °C لمدة دقيقة واحدة، تليها 30 دورة عند 94 °C لمدة 30 ثانية.

درجة حرارة 54 °C لمدة 30 ثانية و68 °C لمدة 1.5 دقيقة. بعد عملية التضخيم، يتم تحضير هلام agarose بتركيز 1% يحتوي على بروميد مناسب مع 48 بئراً تتوافق مع التحميل باستخدام ماصة متعددة القنوات. اخلط 4 µL من ناتج PCR مع 1 µL من منظم تحميل DNA بتركيز 5X.

قم بتحميل العينات على هلام agarose في طبق يحتوي على 96 بئراً باستخدام ماصات متعددة القنوات بسعة 10 microliter. قم بإجراء عملية الفصل الكهربائي عند 135 volts لمدة 30 دقيقة. افحص الحزم على الهلام باستخدام نظام UVP للتوثيق والتحليل.

قم بتنقية نواتج تفاعل PCR باستخدام طقم تنقية PCR pure link 96 عن طريق الطرد المركزي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لاستخلاص DNA. أضف 40 µL من الماء المقطر المزدوج المعقم إلى كل بئر في لوحة الربط. اختر عشوائياً عدة قطع من تضاعفات الـ DNA المنقاة في اللوحة لفحص تركيزات DNA.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop، اضبط تركيز نواتج التضخيم (amplicons) في الطبق لتصل إلى 10 nanograms per microliter تقريبًا. بعد ذلك، استخدم إنزيم eco R one لهضم بلازميد يحتوي على تسلسل مقاومة الكاناميسين ليكون بمثابة قالب لـ PCR. قم بتنقية البلازميد المهضوم باستخدام طقم kayak quick PCR purification، واضبط الحمض النووي للبلازميد الخطي ليصل إلى تركيز نهائي قدره 10 nanograms per microliter.

قم بتجهيز خليط PCR بحجم 25 µL لتضخيم قطعة Cassette المقاومة للكاناميسين، بحيث يتضمن بادئات F two و R two كما هو موضح في الإجراء المكتوب. بالتزامن مع هذا الفيديو، باشر بإجراء تضخيم PCR وفقاً للتعليمات المذكورة هنا. ولفحص ناتج الـ PCR، قم بإجراء الفصل الكهربائي للهلام باستخدام هلام agarose بتركيز 1%.

بعد ذلك، قم بتجميع كمية كبيرة من نواتج تضخيم كاسيت مقاومة الكانامايسين من 10 أفراد تم تنقيتها بواسطة PCR. اضبط تركيز نواتج التضخيم لتصبح 10 nanograms per microliter. إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو الحصول على ناتج PCR النهائي الكفء خطياً من نواتج PCR الثلاثة.

لضمان النجاح، يتم ضبط كميات القوالب الثلاثة المستخدمة في تفاعل PCR لتكون متساوية تقريباً. اخلط 1 µL من كل من محاليل PCR الثلاثة بتركيز 10 ng/µL في لوح PCR واحد، بالإضافة إلى قالب PCR. ثم قم بتحضير خليط PCR، بما في ذلك البادئات F1 و R الثلاثة كما هو موضح في الإجراء المكتوب.

بعد ذلك، قم بإجراء تضخيم PCR للعينات. افحص نواتج تضخيم PCR (PCR amplicons) باستخدام هلام الأجاروز بعد تنقية نواتج تضخيم PCR وتقدير كميتها. وكما سبق، قم بتجميد نواتج تضخيم PCR المجمعة عند درجة حرارة -20 °C.

للبدء، قم بتحضير وسط Todd Hewitt ومصل الحصان وفقاً للتعليمات الواردة في الإجراء المكتوب المرفق بهذا الفيديو، ثم وزع 2 mL من الوسط و 10 mL من الوسط في أنبوبين مخروطيين سعة 15 mL. قم بتلقيح 5 µL من المخزون المذاب لـ s sanguine SK 36 الذي كان مجمداً عند -80 °C في 2 mL من الوسط. قم بحضن المزرعة محكمة الإغلاق طوال الليل عند 37 °C.

قم أيضاً بالتحضين المسبق لأنبوب الوسط سعة 10 milliliter تحت الظروف نفسها بعد التحضين طوال الليل. انقل 50 microliters من المزرعة إلى أنبوب الوسط سعة 10 milliliter. حضّن الأنبوب عند 37 degrees Celsius لمدة ثلاث ساعات.

مباشرة بعد الحضن، أضف 2 µL من الببتيد المحفز للكفاءة SK 36 بتركيز 70 ng إلى أنابيب einor على قالب مكون من 96 بئراً، وقم بتسخينها مسبقاً عند 37 °C. انقل 330 µL من مزرعة SK 36 التي تم حضنها لمدة ثلاث ساعات إلى كل أنبوب. استبدل الـ DNA بماء مقطر مزدوج معقم كعينة ضابطة.

قم بتحضين الأنابيب عند 37 °C لمدة ساعة واحدة بعد التحضين. ضع الكتلة على الثلج، ثم وزع 100 µL من كل عملية تحول على أطباق أغار brain heart infusion أو BHI تحتوي على 500 µg/mL من kanamycin، وحضن الأطباق عند 37 °C لمدة يومين تحت ظروف micro aerobic. لكل طفرة استبدالية، اختر عشوائياً مستعمرتين فرديتين والقِ كل مستعمرة في 5 mL من BHI يحتوي على 500 µg/mL من kanamycin. حضن كل لقاح طوال الليل عند 37 °C تحت ظروف micro anaerobic.

يتم الحفظ بالتجميد لكل مستنبت في 30% glycerol عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. وللتحقق مما إذا كان الطافر يحتوي على استبدال الجين المتوقع، يُجرى تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرات (colony PCR) لكل طافر باستخدام البادئات F1 و R three في لوحة PCR ذات 96 بئراً.

استخدم حوالي 1 µL من المزرعة الليلية من كل مستعمرة فردية كقالب DNA في تفاعل تضخيم PCR بحجم 25 µL. ابدأ بإجراء تضخيم PCR لتأكيد استبدال الجين الطافر من أجل التحديد الدقيق للطفرات ذات النطاق المزدوج أو نواتج PCR الملوثة. افحص ناتج PCR عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام لمدة أربع ساعات على هلام يتجاوز طوله 12 cm.

هلام أغاروز بتركيز 2% مع صبغ بروميد الإيثيديوم تحت ظروف الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز هذه. يمكن تحديد أي نواتج تضخيم يوجد بينها فرق يبلغ 100 زوج قاعدي أو أكثر بوضوح. بدلاً من ذلك، عندما يكون من المتوقع أن يقل الفرق عن 100 زوج قاعدي بين النطاقات الناتجة عن تضخيم كاسيت مقاومة الكاناميسين والجين من النوع البري، استخدم بادئ T1 داخلي للجين المستهدف لتحديد ما إذا كان يمكن الكشف عن الجين من النوع البري بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR.

لتأكيد الحذف بشكل أكبر، قم بتنقية نواتج التضخيم (amplicons) باستخدام طقم تنقية الـ PCR من نوع pure link 96، ثم أجرِ التسلسل باستخدام البادئ P one الذي يرتبط بكاسيت مقاومة الكانامايسين؛ احتفظ فقط بالطفرات الصحيحة التي تم تأكيدها عن طريق التسلسل بعد تضخيم الـ PCR باستخدام البادئين F1 و R one للتسلسل العلوي (upstream) والبادئين F three و R three للتسلسل السفلي (downstream). تم الحصول على ما يقرب من 1 kilobase علوياً وسفلياً لكل جين من جينات *S. sanguineous* بتنسيق 96-well تحت ظروف الـ PCR وباستخدام البادئات المصممة.

تم تضخيم ناتج محدد من الحمض النووي الجينومي لـ s sanguine في كل تفاعل PCR، مما أشار إلى أن البادئات كانت محددة للغاية تجاه أهداف s sanguine من خلال إعادة التضخيم بواسطة PCR باستخدام البادئات F1 و R ثلاثة ونواتج تضخيم ثلاثة كقوالب للحمض النووي. تم إنشاء تركيبات PCR معاد تركيبها خطية بإنتاجية عالية. على طبق مكون من 96 بئراً يتألف من منطقة تسبق كل جين مستهدف، وكاسيت cany، ومنطقة تلي كل جين مستهدف بهذا الترتيب، تم بعد ذلك تحويل تركيبات PCR المعاد تركيبها إلى s sanguine SK 36 واختيارها بواسطة cany على أطباق أغار BHI.

بالنسبة لغالبية عمليات التحول، تم الحصول على أكثر من 1000 مستعمرة في كل طبق بعد تحضين دقيق هوائي لمدة يومين. وعندما تم تضخيم هذه المستعمرات باستخدام PCR بواسطة F1 و R three، لوحظ شريط DNA واحد يتوافق مع الحجم المتوقع للطفرة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام عند محاولة حذف جينات يحتمل أن تكون أساسية. كما لا ينبغي الحصول على أي مستعمرات في غالبية عمليات التحول عند حذف بعض الجينات الأساسية.

ومع ذلك، تم الحصول على مستعمرات بعد عملية التحول، وعقب تضخيم هذه المستعمرات بواسطة PCR باستخدام بادئات F1 و R، ظهرت ثلاث حزم على هلام NA ثنائي الأبعاد تتوافق مع الحجم المتوقع للطفرة وحجم النوع البري، كما كشف الفصل الكهربائي للهلام. وبالنسبة لبعض الطفرات، كان الحجم المتوقع للطفرة وحجم النوع البري لنواتج تضخيم PCR متقاربين جداً بحيث تعذر فصلهما باستخدام هلام الأجاروز الطويل. وفي هذه الحالة، تم تصميم بادئ داخلي T one للجين المستهدف بناءً على تسلسل جين النوع البري.

تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام البادئ T one الداخلي والبادئ F1. واستُخدمت السلالة البرية SK 36 كسلالة ضابطة موجبة لهذا التفاعل. وفي حال تضخيم حزمة بالحجم المتوقع من الطفرة باستخدام البادئ الداخلي، يُصنف الجين على أنه جين أساسي.

بما أنه تم التأكد سابقاً من وجود كاسيت can mycin في الطفرة عن طريق تسلسل DNA باستخدام بادئ P one، فقد تم جمع 2048 طفرة لجينات غير أساسية في S sanguineous بناءً على هذا البروتوكول، مع استبعاد أطر القراءة المفتوحة الأربعة التي كانت محتواة بالكامل ضمن أطر قراءة مفتوحة أخرى.

تم تحديد 218 جيناً، والتي تُعد أساسية لبقاء s sanguine على قيد الحياة، في ظل الظروف التجريبية. بعد مشاهدة هذه الفيديوهات، أعتقد أنه يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء طفرات جينية على نطاق الجينوم الكامل باستخدام تقنية PCR عالية الإنتاجية.