عزل الخلايا الصباغية تشبه الأولية من القلب ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا تشبه الخلايا الميلانينية القلبية القابلة للحياة من قلب الفأر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استئصال القلوب من الفئران التي تم قتلها رحيمًا. وتتمثل الخطوة الثانية في فرم القلوب وتفكيك الخلايا باستخدام الهضم الإنزيمي والتحريك الميكانيكي.

بعد ذلك، يتم إجراء طرد مركزي لمعلق الخلايا، ثم يُعاد تعليق الراسب الذي يحتوي على الخلايا القلبية والخلايا الشبيهة بالخلايا الميلانينية. وتتمثل الخطوة النهائية في زرع الخلايا واستنباتها. ويمكن استخدام الخلايا الشبيهة بالخلايا الميلانينية القلبية التي تم عزلها في النهاية لإجراء دراسات الرقع أو تحليل المصفوفات الدقيقة استجابةً للمجهدات المرضية الفسيولوجية لتقييم الاستثارة الخلوية أو حالة المجموع النسخي (transcriptome).

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية المصممة لعزل واستزراع الخلايا العضلية القلبية في أنها تؤدي إلى عزل العديد من الخلايا الشبيهة بالخلايا الميلانينية القلبية القابلة للاستخدام. حسناً، لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما اكتشفنا مجموعة خلوية جديدة في قلب الفأر، وأردنا استقصاء وظائفها الفسيولوجية. للبدء، قم بتجهيز مجموعتين من الأدوات الجراحية المعقمة، إحداهما لتشريح القلوب والأخرى لفرم الأنسجة.

بعد ذلك، قم بتحضير مكملات الوسط، ولكن انتظر حتى لحظة زراعة الخلايا قبل إضافتها إلى أوساط الزراعة. وبعد تحضير أوساط الزراعة، قم بترشيح المحلول لتعقيمه أثناء العمل داخل خزانة تدفق الهواء الرقائقي لزراعة الأنسجة، ثم خزن الأوساط عند درجة حرارة 4 °C. قم بتحضير محلول DNA's one عن طريق إضافة 0.05 grams من DNA's one إلى 100 milliliters من DPBS مع 10% FBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول تربسين 0.5% عن طريق إضافة 0.5 grams من trypsin إلى 100 milliliters من DPBS مع المضادات الحيوية. وأخيراً، قم بتجميع المعدات الأخرى اللازمة لإتمام الإجراء، بما في ذلك أطباق بتري، وأنابيب مخروطية سعة 50 milliliter، ومصافٍ خلوية بمسامية 40 micron، وDPBS مع المضادات الحيوية، وأطباق زراعة بمقاس 60 millimeter و35 millimeter. بعد قتل جرائب الفئران حديثة الولادة من P zero إلى P two رحمةً، امسح منطقة الصدر بالكحول وضعها في طبق P two مقاس 10 centimeter يحتوي على DPBS، وأثناء العمل تحت مجهر ستيريو، افتح التجويف الصدري بعناية واستخرج القلب كاملاً مع الأذينين المتصلين به.

اغسل القلوب في محلول DPBS وانقلها إلى طبق بتري جديد بقطر 10 سنتيمتر. انقل طبق بتري الذي يحتوي على القلوب المستأصلة إلى غطاء زراعة الأنسجة، واتبع التقنية المعقمة في الخطوات التالية. أولاً، اغسل القلوب ثلاث مرات في محلول DPBS معقم مضاف إليه مضادات حيوية.

ضع القلوب في طبق زراعة بقطر 60 millimeter وأضف من ستة إلى ثمانية milliliters من محلول trypsin بتركيز 0.5%. بعد ذلك، قطع القلوب إلى قطع صغيرة واحضنها عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة. بعد اكتمال فترة الحضن، اسحب المحلول الناتج من الطبق إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 10 milliliter.

باستخدام ماصة معقمة سعة 10 milliliter، قم بإعادة تعليق المحلول بسرعة ولكن بلطف من 30 إلى 50 مرة، ثم قم بترشيح المعلق الناتج عبر مصفاة خلايا بمسامية 40 micron في أنبوب مخروطي جديد ونظيف سعة 50 milliliter. بعد عملية الطرد المركزي، قم بسحب السائل الطافي بلطف وأعد تعليق الراسب المتبقي في ستة إلى ثمانية milliliters من محلول DPBS المعقم. كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين.

بعد عملية الشطف الثالثة التي تلي الطرد المركزي، قم بتصريف أو سحب محلول الغسيل بعناية، ثم أعد تعليق الراسب في ستة ملليلترات من وسط زراعي مضاف إليه مكملات. بعد ذلك، اسحب المحلول المعاد تعليقه باستخدام ماصة نقل معقمة وضع الخلايا في طبق بقطر 35 ملم. قم بسحب الخلايا القلبية المعزولة من ثلاثة فئران حديثة الولادة بعد تحضينها طوال الليل، ثم اسحب الوسط الزراعي مع أي خلايا غير ملتصقة، واشطف الأطباق مرة واحدة باستخدام DPBS، ثم أضف وسطاً طازجاً إلى الأطباق واستبدل الوسط.

يمكن الحفاظ على الخلايا المعزولة من القلوب الوليدية أو الجنينية في المزرعة لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع مع تغيير الوسط كل يومين، بينما يمكن الحفاظ على الخلايا المعزولة من قلوب البالغين في المزرعة لمدة تصل إلى 10 أيام. لعزل خلايا شبيهة بالخلايا الميلانينية من قلب فأر بالغ، ابدأ بغسل القلوب المستأصلة في محلول DPBS معقم يحتوي على مضادات حيوية داخل غطاء استزراع الأنسجة. اضغط على القلب قليلاً باستخدام ملقط تشريح منحني لإزالة أي دم متبقٍ، ثم اشطف القلب بمحلول DPBS مرة أخرى.

بعد ذلك، قم بإزالة الأذينين والحلقة الأذينية البطينية من القلوب، وضع عينات الأنسجة المستأصلة في طبق قطرُه 35 مليمتر. قم بتقطيع القلوب إلى قطع صغيرة باستخدام مقص منحني وملقط. أضف من 6 إلى 8 مليلتر من محلول trips in بتركيز 0.5% إلى الطبق، ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 45 إلى 60 دقيقة.

بعد فترة الحضن، كرر الخطوات الموضحة سابقاً للحصول على معلق من الخلايا القلبية البالغة وعملية الزرع السابقة. في هذا المثال، يحدد السهم الأبيض الخلايا الميلانينية القلبية في كلا اللوحتين. لاحظ أنه بدون الاستعانة بالوسم الفلوري، يصعب تحديد الخلايا الميلانينية القلبية وتمييزها عن الخلايا العضلية الأذينية الملتصقة بالطبق، ويشير رأس السهم الأزرق الفاتح إلى الخلايا الأذينية التي ليست ملتصقة جيداً بالطبق الموضح هنا، وهي خلايا ميلانينية قلبية سليمة معزولة من قلب فأر حديث الولادة.

لقد طورت هذه الخلايا استطالات شجيرية واسعة، وهي تشبه إلى حد كبير الخلايا الميلانينية الجلدية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون بضع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا ميلانينية حية من القلب.

سيكون ذلك مناسباً للتحليل الفسيولوجي والجزيئي.