طريقة مبتكرة لثقافة الاستقطاب وتحفيز من explants الإنسان مخاطية الأمعاء

الهدف العام من التجربة التالية هو محاكاة الوضع الحيوي (in vivo) لتحفيز المخاطية المعوية البشرية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق لصق أسطوانة تجويفية على الجانب القمي للنسيج لمنع المادة المحفزة من ملامسة الجانب القاعدي الجانبي. وفي خطوة ثانية، يتم تطبيق المحفز، مما سيسمح بتحليل الاستجابة المناعية الناتجة.

بعد ذلك، يتم إزالة المحفز من الجانب القمي للنسيج من أجل الحفاظ على حيويته لمدة تتراوح بين 24 و36 ساعة. ويمكن أن تظهر النتائج التي تم الحصول عليها تأثيرات متباينة لسلالات مختلفة من البروبيوتيك بناءً على بيانات الكيمياء النسيجية المناعية، وإفراز السيتوكينات، وتحليل المظهر العام، وما إلى ذلك. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل غرفة ASIC في أنها تسمح بتحليل ما يصل إلى 20 حالة في وقت واحد.

تسمح هذه الطريقة بتمديد فترة الزرع حتى 36 ساعة، كما توفر مادة كافية لإجراء تحليلات قراءة متنوعة مثل تحليل DNA وRNA، والكيمياء النسيجية المناعية، وإفراز السيتوكينات، وما إلى ذلك. ومع أن هذه الطريقة يمكن أن تقدم رؤى في مجال المعززات الحيوية (probiotics)، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً في تقنيات أخرى ولدراسة تأثير المعدلات المناعية الأخرى مثل الأدوية البيولوجية، والأدوية المضادة للالتهابات، وغيرها. يجب الحصول على أنسجة المخاطية المعوية من أفراد أصحاء أو مصابين بمرض التهاب الأمعاء أثناء الجراحة.

بمجرد استئصال العينة، يتم نقلها بسرعة إلى المختبر مع الحفاظ عليها مبردة في محلول HBSS المضاف إليه pen strep. ثم ابدأ بغسل النسيج بالمحلول المنظم وإزالة أي مواد مساريقية. بعد ذلك، افصل طبقة المخاطية عن الطبقة تحت المخاطية باستخدام مقص وملاقط معقمة مع إبقاء النسيج في محلول HBSS المنظم.

في طبق بيتري، ليس من الضروري إبقاء النسيج مغموراً بالكامل، ولكن يجب تجنب لمس السطح المخاطي بالملقط قدر الإمكان. بعد ذلك، يتم تقطيع المخاطية إلى شرائط بعرض سنتيمتر واحد على الأقل وبأقصى طول ممكن، باستخدام مشرطين معقمين بطريقة تشبه تقطيع الطعام. وبمجرد الانتهاء من التقطيع، يتم غسل وتنظيف المخاطية بلطف في محلول HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم.

أخيرًا، قم ببسط شرائح المخاطية في طبق بتري بحيث تكون الجوانب القمية متجهة للأعلى. ابدأ بتحضير TIS DMEM طازج. بعد ذلك، املأ طبق بتري بقطر 10 centimeter بنحو 30 milliliters من F-B-S-N-A واغمر شبكة حديدية بالكامل في المحلول.

اترك الطبق مفتوحاً وضع الأسطوانات البلاستيكية على الطبق.الغطاء. الآن اسحب 3 µL من الغراء الجراحي إلى الماصة وقم بتطبيق الغراء بعناية على أحد حدود الأسطوانة البلاستيكية مع تثبيتها بإحكام باستخدام الملقط. بعد ذلك، ضع الأسطوانة برفق على الجانب القمي للمخاطية بأقرب نقطة ممكنة من حدود إحدى الشرائح أثناء جفاف الغراء.

قم بتوزيع 850 إلى 1000 µL من الوسط في البئر المركزي لصفيحة الأنسجة، وثبّت الشبكة الحديدية على حواف البئر المركزي للصفيحة. باستخدام مشرطين، قم بقص الأنسجة الزائدة من حدود الأسطوانة. الآن، ارفع الأسطوانة برفق مع الأنسجة الملتصقة بها، وضع الجانب القاعدي الجانبي للنسيج على الشبكة الحديدية في مركز الصفيحة.

بعد ذلك، ابدأ بعملية تحفيز الأنسجة. قم بتطبيق المحفزات المطلوبة في مركز الأسطوانة البلاستيكية بالتركيز المحدد. تجنب ملامسة طرف الماصة للأسطوانة أو للسطح المخاطي، وقم بتغطية السطح الموجود داخل الأسطوانة بشكل متجانس.

قم الآن بحضن النسيج لمدة تصل إلى ثلاث ساعات. كما يمكن الحضن لمدة تزيد عن ثلاث ساعات باستخدام حجم أقل من محلول المحفزات. بعد انتهاء الحضن، قم بإزالة المحفزات من السطح القمي للنسج، ولكن لا تستبدلها بوسط جديد.

إن إضافة الوسط الغذائي ستؤدي إلى اختناق الأنسجة. الآن، قم بملء جرة الأكسجين بضغط جوي واحد من الأكسجين بنسبة 100% لمدة 24 ساعة من وقت الزرع. توخَّ الحذر دائماً عند التعامل مع أسطوانة الأكسجين وتأكد من إغلاقها بإحكام بعد الاستخدام.

بعد استكمال زراعة التحفيز لمدة 24 ساعة، استخدم مشرطاً لإزالة الأسطوانة بعناية من النسيج عن طريق كشط الغراء برفق. بعد ذلك، قم بتثبيت النسيج لإجراء اختبارات الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أو المقايسات المناعية الفلورية. أما بالنسبة لتحليل التعبير الجيني أو تحليل البروتين، فقم بتجميد النسيج تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل.

بعد ذلك، يتم جمع الوسط الجانبي القاعدي لتحليل نمط إفراز السيتوكينات. عقب ذلك، يُنقل الوسط إلى أنبوب طرد مركزي وترسب الشوائب باستخدام البروتوكول الموضح. تم استزراع مخاطية الأمعاء البشرية السليمة والمصابة بمرض التهاب الأمعاء (IBD) لمدة 24 ساعة على الأقل مع الحفاظ على سلامة الأنسجة.

كان هذا ممكناً فقط إذا تم قضاء 85% على الأقل من وقت الزرع في بيئة غنية بالأكسجين. أما المخاطية المستزرعة بالطريقة التقليدية فلا تحقق نتائج جيدة. بعد ذلك، تم تحفيز النسيج السليم باستخدام بكتيريا السالمونيلا الغازية المحفزة للالتهاب.

بعد ساعتين من التلقيح، كان تدمير الطبقة العليا من الظهارة مرئياً بالفعل مقارنة بالمجموعات الضابطة. وبعد 24 ساعة، أصبح التحلل واسع النطاق تماماً. تتوفر مناقشة أعمق للتطبيقات التجريبية مع النتائج المنشورة في المخطوطة المكتوبة بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين العاملين في مجال أمراض الجهاز الهضمي لدراسة التفاعل بين العائل والميكروبات في القناة الهضمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استزراع الغشاء المخاطي المعوي البشري وتحفيزه موضعياً. لا تنسَ أن التعامل مع العينات البشرية قد يكون خطيراً للغاية، ويجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة دائماً عند تنفيذ هذا الإجراء.