التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (الرنين المغناطيسي الوظيفي) مع التحفيز السمعي في الطيور المغردة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح بروتوكول محسن للتصوير الناجح لإدراك الصوت ومعالجته في المناطق السمعية ومناطق التحكم في الغناء في دماغ الطيور المغردة. ويتم تحقيق ذلك باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي من خلال إعداد محفزات سمعية ذات جودة عالية أولاً، والتي يمكن دمجها في نموذج كتلي (on-off block paradigm) لتقديمها للطائر أثناء عملية المسح بالتصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي أو FMRI. وتتمثل الخطوة الثانية في تجهيز الطائر للمسح عن طريق تخديره أولاً، ثم وضعه على سرير حيوانات مكيّف، يُوضع لاحقاً في تجويف جهاز التصوير بالرنين المغناطيسي. بعد ذلك، يمكن الحصول على صور FMRI أثناء التحفيز السمعي.

تتمثل الخطوة النهائية في المعالجة المسبقة لبيانات MRI المكتسبة، بما في ذلك معايرة الصور وفقاً لأطلس طائر zebra finch. وفي النهاية، يُستخدم التحليل الإحصائي القائم على الفوكسل للسماح بتصور النتائج التي تم الحصول عليها وتحديد موقع تنشيطات الدماغ الناجمة عن المحفزات السمعية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى الأكثر شيوعاً في أبحاث طيور الشمس، مثل الفيزيولوجيا الكهربائية وعلم الأنسجة وتقنيات الخرائط الجزيئية، في أن FMRI هي طريقة غير جراحية داخل الجسم (in vivo)، مما يسمح بدراسة نفس العينة بمرور الوقت وفحص الدماغ بأكمله في آن واحد دون وضع فرضيات مسبقة حول موقع الركائز العصبية المشاركة في العملية قيد البحث.

قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تطبيق التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (fMRI) في الطيور يختلف تماماً وهو أكثر تحدياً بكثير من استخدام الطريقة ذاتها في البشر أو القوارض. ولا يعود ذلك فقط إلى صغر حجم أدمغة هذه الكائنات، بل أيضاً لأن جمجمتها تتكون من تجاويف هوائية عديدة، مما يتسبب في ظهور عيوب الحساسية (susceptibility artifacts)؛ ومن خلال استخدام تسلسل صدى الدوران (spin echo sequence) الذي يكون أقل عرضة لهذه العيوب مقارنة بتسلسل التدرج (gradient sequence)، يمكننا إجراء تصوير وظيفي لكامل دماغ الطائر المغرد بدقة مكانية جيدة جداً. وتعد فتحة الماسح الضوئي مساحة ضيقة يمكن أن تؤدي إلى تشويه المحفزات السمعية.

لذلك، وبدءاً في التحضير لهذا البروتوكول، قم بتسجيل المثيرات الصوتية أثناء تشغيلها داخل تجويف نظام الرنين المغناطيسي بقدرة 7 تسلا باستخدام ميكروفون ليفي بصري، وتحقق من التشوهات الخاصة بنظام MRI المستخدم. يمكننا هنا ملاحظة الترددات التي تم تعزيزها أو كبحها كما تظهر في تسجيلات الضوضاء البيضاء التي أجريت خارج الماسح وفي موقع رأس الطائر داخل تجويف المغناطيس. ولتعويض هذا التعزيز الاصطناعي، قم بتطبيق وظيفة الموازن (equalizer) على كل مثير باستخدام برنامج wave lab للإعداد الموضح.

في هذا البروتوكول، تتكون الدالة من نواة غاوسية (Gaussian kernel) وفقاً للمعلمات الموضحة على الشاشة. هنا، يجب أن تتكون محفزات الأغاني من عدة زخارف غنائية فردية لطائر معين تتخللها فترات صمت؛ يتم ضبط مدة هذه الفترات الصامتة للحفاظ على تطابق إجمالي مقدار الصوت والصمت عبر جميع المحفزات. يبلغ الطول الإجمالي لكل محفز 16 ثانية، وهو ما يتوافق مع وقت الحصول على صورتين من تصوير الرنين المغناطيسي الوظيفي (FMRI).

استخدم برنامج تحضير لتوحيد شدة كل أغنية من حيث متوسط المربعات المرجح (matched root means square) وتطبيق مرشح تمرير عالي عند 400 hertz قبل دمجها في المثير الكامل. يمكن تصميم التجربة باستخدام برنامج عرض متبعاً تصميم المجموعات (block design) بنظام التشغيل والإيقاف، بحيث تتناوب فترات التحفيز السمعي مع فترات الراحة. يجب أن تستغرق كل مجموعة 16 seconds بما يتوافق مع وقت الحصول على صورتين؛ يتم تقديم كل نوع من المثيرات 25 مرة، مما يؤدي إلى الحصول على 50 صورة لكل مثير ولكل شخص خاضع للتجربة.

يجب تعشيو ترتيب تقديم الظروف التجريبية داخل المجموعات وبين المشاركين. كما يجب إعداد النموذج التجريبي بحيث يستقبل إشارات تحفيز (triggers) من الماسح الضوئي. يضمن ذلك أنه أثناء المسح في كل تكرار ضمن تسلسل FMRI، سيقوم برنامج الماسح بإرسال إشارة تحفيز إلى برنامج العرض السمعي، والذي بدوره سيسجل رقم المسحة وينفذ الأمر المقابل.

نقدم هنا بروتوكولاً تم تكييفه خصيصاً للاستخدام مع طيور الزيبرا الفنش البالغة. يجب إيواء طيور الزيبرا الفنش في أقفاص طيران تحت دورة ضوئية تبلغ 12 ساعة من الضوء و12 ساعة من الظلام، مع توفير الغذاء والماء حسب الرغبة طوال فترة الدراسة. والحد الأدنى لعدد الأفراد في كل تجربة هو 15 فردًا.

يأخذ هذا الرقم في الاعتبار حساسية التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (fMRI) بتقنية صدى الدوران، والتباين الطبيعي بين الأفراد في الظواهر البيولوجية المقاسة في التجربة. وللتحضير للتجربة، قم أولاً بتوصيل قناع المنقار بجهاز التحكم في الغاز باستخدام أنابيب بلاستيكية، وثبته على سرير التصوير بالرنين المغناطيسي في نظام رنين مغناطيسي بقدرة 7 T. افتح أسطوانتي غاز الأكسجين والنيتروجين وقم بتشغيل جهاز التحكم في الغاز.

قم أيضاً بتشغيل النظام الذي يتم التحكم فيه بالتغذية الراجعة وجهاز تدفق الهواء الدافئ. بعد ذلك، قم بتخدير عصفور الزيبرا باستخدام 3% isof fluorine في خليط من الأكسجين والنيتروجين عن طريق إدخال منقاره في القناع وتثبيت الرأس حتى يتم تخدير الطائر بالكامل. ويمكن التحقق من ذلك عن طريق سحب المخلب برفق.

عندما يصبح الطائر تحت تأثير التخدير الكامل، لن يقوم بسحب المخلب. بالإضافة إلى ذلك، ستكون عينا الطائر مغمضتين. قم بإدخال مسبار درجة حرارة مخرجي لمراقبة درجة حرارة الجسم طوال التجربة، وضع مستشعراً نيوماتيكياً أسفل البطن لمراقبة معدل التنفس.

ثم ضع سترة لتقييد جسم الطائر طوال فترة التجربة. حافظ على معدل التنفس في نطاق يتراوح من 40 إلى 100 نفساً في الدقيقة، وأبقِ درجة حرارة الجسم ثابتة عند 40 درجة. إذا كان نطاق التنفس منخفضاً جداً أو مرتفعاً جداً، فقم بتعديل مستوى التخدير وفقاً لذلك.

إذا استمرت المشكلة، يجب إيقاف التجربة وإخراج الحيوان من التجهيزات. ومن أجل التعافي، ضع مكبرات صوت ديناميكية غير مغناطيسية على جانبي رأس طائر zebra finch وقم بتوصيلها بالمضخم. تأكد من إبعاد أسلاك مكبرات الصوت عن مسبار درجة الحرارة لأن ذلك قد يؤثر على قراءة درجة الحرارة.

عندما تكون المسافة قريبة جداً، ضع ملف RF السطحي فوق رأس عصفور الزيبرا. ثم ضع عصفور الزيبرا في مركز المغناطيس. وأخيراً، قلل مستوى التخدير إلى 1.5% ISO fluorine قبل البدء في الفحص.

لبدء عملية المسح، حدد أولاً موضع الدماغ داخل المغناطيس. قم بالحصول على مجموعة واحدة من صور الاستطلاع ذات الشريحة الواحدة (single slice gradient, echo scout images) في المستويات السهمية والأفقية والإكليلية، بالإضافة إلى صور استطلاع متعددة الشرائح تُستخدم لاحقاً لتحديد موضع المسوحات الوظيفية. بعد ذلك، قلل من ضوضاء التدرجات عن طريق زيادة أوقات الصعود (ramp times) إلى 1000 microseconds.

بعد ذلك، قم بإعداد تسلسل الاسترخاء المعزز للاكتساب السريع، والمعروف باسم rare T2 weighted fMRI. ثم حدد 15 مقطعاً سهمياً تغطي كامل الدماغ تقريباً. الآن، اختر البروتوكول السمعي في برنامج العرض لضمان عدم فقدان برنامج العرض السمعي لأي إشارة تحفيز من الماسح الضوئي.

ابدأ بتشغيل البروتوكول السمعي أولاً. وبمجرد تحميل البروتوكول بالكامل، ابدأ تسلسل FMRI. يجب أن يسبق كل تجربة FMRI الحصول على 10 صور وهمية (dummy images) للسماح للإشارة بالوصول إلى حالة الاستقرار قبل بدء التحفيز السمعي.

بعد اكتمال عملية الاستحواذ، يتم تصفير البيانات. قم بتعبئة البيانات لتصبح 64 × 64. ولتحديد جودة البيانات، ألقِ نظرة أولية على النتائج باستخدام الأداة الوظيفية.

في برنامج ParaVision، احسب استجابة الدمج التفاضلية بين جميع كتل التنشيط والخط القاعدي. إذا لم يُلاحظ أي تنشيط في المناطق السمعية الأولية، فمن المحتمل أن الطائر لم يسمع أو لم يعالج المثيرات السمعية بسبب مشكلات تقنية أو مستوى التخدير. يجب التحقق من الإعدادات وإعادة القياس.

بعد الحصول على البيانات الوظيفية، قم بتشغيل تتابع تصوير تشريحي ثلاثي الأبعاد T2-weighted عالي الدقة بنفس توجيه مسوحات FMRI السابقة. بعد ذلك، قم بتعبئة هذه البيانات بالأصفار (Zero-fill) لتصل إلى 256 × 256 × 256.

أخيرًا، قم بإزالة عصفور الزيبرا من سرير التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) واتركه ليتعافى من التخدير في قفص تحت مصباح حراري. وعادةً ما يستغرق تعافي عصفور الزيبرا من تخدير ISO fluorine أقل من خمس دقائق. وبعد بضع دقائق فقط، سيحاول الطائر الوقوف، وبمجرد تعافي الطائر تمامًا، سيعود للجثوم على غصن بدلاً من الجلوس في قاع القفص لبدء معالجة البيانات.

أولاً، قم بتحويل بيانات الرنين المغناطيسي (MR) إلى صيغة analyze أو nifty. ثم قبل البدء في معالجة البيانات باستخدام برنامج SPM، من الضروري تكييف بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (FMRI) الخاصة بطيور المغردة عن طريق ضرب حجم الفوكسل في 10. ونظراً لأن برنامج تحليل FMRI قد تم تطويره لمعالجة بيانات FMRI المأخوذة من البشر، فإن أبسط طريقة للمضي قدماً هي زيادة حجم الفوكسل لبيانات FMRI الخاصة بالطيور اصطناعياً باستخدام برنامج MRI Crow.

لاحظ أن هذا الضبط لا يؤثر على البيانات نفسها، حيث لا يتم تطبيق أي إعادة لأخذ العينات أو أي تعديلات أخرى على البيانات. بعد ذلك، يتم إجراء المعالجة الأولية للبيانات المكتسبة.

باستخدام SPM eight، قم أولاً بإعادة محاذاة بيانات FMRI والتسجيل المشترك لمجموعة البيانات التشريحية ثلاثية الأبعاد (3D) مع السلسلة الزمنية لـ FMRI. بعد ذلك، قم بتطبيع البيانات ثلاثية الأبعاد والسلسلة الزمنية لـ FMRI التي خضعت للتسجيل المشترك وفقاً لأطلس الدماغ الخاص بطائر الزيبرا فينش (zebra finch brain MRI Atlas).

قم بتطبيق مصفوفة التحويل على مجموعة بيانات FMRI وقم بتنعيم البيانات باستخدام نواة Gaussian بمقدار 0.5 millimeter. ثم أجْرِ تحليلاً إحصائياً قائماً على الفوكسل في برنامج SPM eight، أولاً على مستوى الطيور الفردية، يليه التحليل على مستوى المجموعة. وأخيراً، لتصور النتائج وتحديد مواقع التنشيطات الوظيفية، قم بإسقاط الخريطة البارامترية الإحصائية على أطلس zebra finch، وهو أطلس دماغ zebra finch ثلاثي الأبعاد عالي الدقة؛ علماً بأن الإحداثيات المجسمة المستخدمة في التحليل الموصوف لنتائج FMRI لـ zebra Finch قد صُممت لهذه التجربة في مختبر التصوير الحيوي (Bioimaging lab)، وهي مجموعة بيانات MRI Atlas.

تتوفر تخطيطات الدماغ وتخطيطات النوى مجانًا عبر الموقع الإلكتروني الموضح هنا. يُظهر هذا الشكل عرضًا جانبيًا لتمثيل ثلاثي الأبعاد للنصف الكروي الأيسر مع إسقاط الهياكل المحددة من الأطلس على المقطع السهمي الناصف. يمكننا هنا رؤية مثال لاستجابة BOLD في التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (FMRI) في المنطقة السمعية الأولية الحقل L، والمناطق السمعية الثانوية المجاورة التي استثيرت بواسطة محفزات سمعية مختلفة مقارنة بحالة الراحة.

يتم ترميز قيم T بالألوان وفقاً للمقياس المعروض في الشكل، ويتم عرض الـ voxels التي كانت نتيجة اختبار T فيها دالة إحصائياً فقط. هذا مثال آخر على تجربة FMRI في طيور zebra finches. وتظهر الصور استجابات انتقائية لأغنية الطائر الخاصة في منطقتي الدماغ XMLD و HVC.

تشير الأرقام الموجودة أسفل الصور إلى الإحداثيات بالملليمتر من الخط الناصف. وتشير الإشارة الموجبة إلى أن المقاطع والنتائج الإحصائية مأخوذة من نصف الكرة المخي الأيمن. يمكن تكييف البروتوكول الموضح في هذا الفيديو بسهولة للتطبيق على أنواع أخرى من الطيور المغردة مثل الزرازير.

هذا مثال على نتائج تجربة من هذا النوع من التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (FMRI). يوضح الشكل في طائر الزرزور التنشيطات التي أحدثتها المحفزات السمعية مقارنة بحالة الراحة لنفس الفرد عبر الفصول المختلفة. إن تطبيق وتحسين التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي في الطيور المغردة يفتح آفاقاً بحثية جديدة في مجال دراسة الطيور المغردة.

لقد ثبت بالفعل أنها تقنية قيمة للتحليل التجريبي للعمليات الحسية الحركية والمعرفية المعقدة التي تكمن وراء التواصل الصوتي في هذه النماذج الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك، وبفضل كونها غير باضعة واتباعها نهج الدماغ الكامل، يمكن استخدام fMRI كطريقة تكميلية لإثراء الطرق الموضعية والباضعة الأكثر شيوعاً. ويُظهر العدد المتزايد من تجارب fMRI في طيور SUNBIRDS قابليتها للتطبيق على الأسئلة البحثية المعرفية، وهو جهد مستقبلي ينبغي بذله من أجل توسيع تجارب MRI إلى ما هو أبعد من المعالجة السمعية، وهي عملية تظل نشطة تحت التخدير، وذلك من خلال استخدام موضوعات مستيقظة معتادة على بروتوكول التصوير.

قد يتيح ذلك إمكانيات بحثية جديدة حيث يمكن للطيور المشاركة بنشاط في تجارب التداخل الكهرومغناطيسي (EMI)، وحيث يمكن التحكم تجريبياً في انتباه الطيور.