العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتوصيف وتمييز الخلايا الجذعية النبضية البشرية عن الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع ضروس العقل المتأثرة الصحية ، وقطعها حول الأسمنت إلى تقاطع المينا في البداية. يتم عزل الخلايا الجذعية المتعددة للأسنان D PSCs بطريقتين مختلفتين.

في الطريقة الأولى ، يتم هضم أنسجة الاورام الحميدة إنزيميا عن طريق احتضانها في محلول الكولاجيناز من النوع الأول بالإضافة إلى القرص. هنا نسميهم ed. بالنظر إلى طريقة العزل في الطريقة الثانية ، يتم وضع أنسجة اللمس فقط في القارورة دون أي هضم.

بهذه الطريقة ، يبدأ dpss في الهجرة من الأنسجة إلى القارورة. تشير هذه الخلايا المسماة OG إلى طريقة عزل النتوء. الخطوة الثانية من الإجراء هي تحديد الخلايا الجذعية باستخدام قياس السقوط الخلوي.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي تحريض تمايز الأرومة السنية ، والخطوة الأخيرة من الإجراء هي التقييم المقارن لتمايز الأرومة السنية بين مجموعتين من خلال التلوين الأحمر و QBCR. أنا RA Kde من قسم الخلايا الجذعية والبيولوجيا التنموية في معهد ريان. سأريكم اليوم توصيف العزل والتمايز المقارن للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية باستخدام طريقتين.

مرحبا ، أنا الدكتور رضائيان من معهد ريو. نحن نعمل على مشروع متعلق بالخلايا الجذعية للب الأسنان البشرية. هذه الخلايا هي نوع من الخلايا الجذعية الميكانيكية ، والتي يسهل الحصول عليها بأقل قدر من الألم والمراضة.

تحدد الخلايا الجذعية Mechy بقدرة أران بلاستيكية ، وتشكيل مستعمرات ، وقدرة تمايز متعددة. مرحبا ، أنا دكتور عامي من قسم الخلايا الجذعية. في المعهد ، نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لعزل الخلايا الجذعية لغرض الدراسات البحثية والتطبيقات المستقبلية.

في الطب التجديدي ، تتمثل الخطوة الأولى لاستخدام هذا المصدر من الخلايا الجذعية للعلاج القائم على الخلايا الجذعية في المستقبل في اختيار أفضل بروتوكول لعزل الخلايا الجذعية عن أنسجة الجزء البشري. من أجل تحقيق هذا الهدف ، من الأهمية بمكان التحقيق في جوانب معينة من السلوك الخلوي في ظل ظروف عزل الخلايا الجذعية المختلفة. أولا ، سأقوم بعزل الخلايا الجذعية للب الأسنان البشرية إما باستخدام التفكك الأنزيمي لللب أو نمو الخلايا الجذعية من زراعة الأنسجة.

ثم قم بتمييزها وتمييزها إلى انفجار الوجين. لذلك دعونا نبدأ. الطريقة الأولى ، الفضاء والكولاجيناز النوع الأول يذوب كلاهما في PBS.

ثم قم بتصفيتها باستخدام مرشح حقنة أوه 0.2 ميكرون. اسحب كلاهما في أنبوب مخروطي الشكل. ثم أضف pener و PBS لتحقيق التركيز النهائي.

انقل ضروس العقل الصحية إلى المختبر في الوسط الأساسي البارد تحت حالة الفولاذ. نظف سطح السن بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الدراسة. تأكد من تنظيف النسيم من سطح السن.

قطع الأسنان حول تقاطع المينا الأسمنتي باستخدام قرص أسنان معقم للكشف عن حجرة اللب. يجب مراعاة أن عملية القطع يجب أن تتم ببطء لتقليل ارتفاع درجة حرارة أنسجة الأسنان. ثم افصل أنسجة اللب برفق عن التاج يعني أنسجة اللب إلى قطعة من واحد إلى ملليمترين باستخدام شفرة Scarpa.

انقل قطعا صغيرة من أنسجة اللب إلى محلول إنزيم مليلتر واحد لمدة ساعة واحدة عند دوامة 37 درجة مئوية كل 30 دقيقة للمساعدة في تفتيت أنسجة اللب. بعد ذلك ، قم بإزالة الركام الكبير عن طريق تمريرها عبر سلالة خلية 70 ميكرون. ثم أضف PBS التي تحتوي على أجهزة الطرد المركزي PENER في 1 ، 200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة supernat بعناية. ثم نعلق اللوحة في وسط التكاثر ، وننقلها إلى قارورة الثقافة ونضيف الوسط. ثم احتضان تحتضن.

قم بتغيير الوسيط كل ثلاثة أيام حتى يتم تحقيق التقاء الخلية لطريقة العمل الخارجي. كرر عملية القطع. بعد قطع الأسنان يعني الأنسجة المنبثقة إلى جزء من واحد إلى ملليمترين.

ثم ضعهم في الثقافة. فلاش مع الانتشار ، متوسط ومحتضن. يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن الحجم الكلي لوسط الانتشار يجب أن يدعم إرفاق جميع القطع لمزيد من نمو الخلية.

قم بتغيير الوسط بعد مراقبة النمو ثم كل ثلاثة أيام حتى يتحقق التقاء الخلية. بالنسبة للتنميط المناعي ، احتضان كلا النوعين من D PSCs مع الأجسام المضادة المترافقة PE أو FITC لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. ثم أضف طرق عرض PBS و centi عند 1 ، 200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية وإعادة التركيب ، اللوحة في PBS وأخيرا قم بتقييم علامات السطح باستخدام الزراعة الفرعية لمقياس التدفق الخلوي ، وكلا النوعين من DPCs لثلاثة مقاطع. ثم تريبسين الثلج وانقلها إلى ستة أطباق استزراع أحمر بنسبة 60٪ بطلاقة Co استبدل PM بوسط السني. تبقى ثلاثة آبار كتحكم سلبي عن طريق إضافة pm.

قم بتغيير الوسيط كل ثلاثة أيام في اليوم 21 اغسل الخلايا باستخدام PBS. ثم قم بإصلاحها بمقدار مليلتر واحد لكل بئر. 10٪ ارتفاع جل رسمي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة المنزل.

بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة المثبت بعناية وقم بتحريك الخلايا ثلاث مرات بالماء المقطر. ثم استبدل الماء بملليلتر واحد لكل ألزا أحمر في محلول وصمة عار حمراء. بعد 20 دقيقة ، نزيل الصبغة الزائدة ونغسل الخلايا أربع مرات بالماء منزوع الأيونات.

ثم أضف ملليمترا واحدا لكل ماء بئر لمنع الخلايا من الجفاف. بعد التلوين ، يمكنك رؤية ثلاثة قضبان تتحول إلى اللون الأحمر مقارنة بعناصر التحكم الموجودة تحت المجهر ، يمكنك رؤية امتصاص لون وصمة عار حول الخلية عن طريق التكبير الكبير لقياس تلطيخ أحمر. بعد إزالة الماء ، أضف ملليلتر واحد لكل بئر ، 10٪ حمض حمضي ، ثم يحتضن لمدة 30 دقيقة مع الرج.

ثم اكشط الخلايا برفق من اللوحة باستخدام مكشطة الخلايا. ثم انقلها إلى الأنابيب المنفصلة. يستغرق VOR بقوة لمدة 30 ثانية.

ثم سخنيها إلى 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لتجنب أنابيب ختم التبخر مع أنبوب نقل ParaView إلى الجليد لمدة خمس دقائق ، استخدموها عند 20 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، اجعل التخفيف التسلسلي القياسي لمرض الزهايمر الأحمر وفقا لبروتوكول المنطقة.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة snat ونقلها إلى الأنابيب الجديدة. تحييد الرقم الهيدروجيني باستخدام 10٪ من الخلايا المائية الأمونيوم. ثم أضف المعايير وكذلك العينات إلى 96.

لوحة جيدة ثم قياس الامتصاص عند 405 نانومتر وتحليل البيانات وفقا للتخفيف التسلسلي القياسي. هنا يمكنك رؤية DPCs ، والتي يتم عزلها عن طريق التفكك الأنزيمي في اليوم 10 و 15 و 18 ، وأيضا تجاوزت DPCs في اليوم الخامس والعاشر والثالث عشر والثامن عشر. كلا النوعين من dpss في sase three في نفس الحجم والتشكل تقريبا تظهر نتائج التنميط المناعي وجود علامات الخلايا الجذعية الوسيطة مثل CD 44 و CD 73 و CD 19 ، وغياب علامات المكونة للدم والبطانة مثل CD 34 و CD 45 و CD 11 B. ومن المثير للاهتمام أن تعبيرات CD 1 0 5 و CD 146 أكثر في d PSCs المتضخمة مقارنة ب D-P-S-C-E-D ، يظهر القياس الكمي للتلطيخ الأحمر بالإنزيم في اليوم 21 من تمايز الأرومة السنية المزيد من ترسب الكالسيوم في D-P-S-C-E-D مقارنة بالجزء العلوي من الخلايا الجذعية بدون أسنان.

تشير نتائج QPCR أيضا إلى تعبيرات أعلى بشكل ملحوظ عن MEP و A LP كعلامات تمعدن في D-P-S-C-D مقارنة بالأسنان المنتهية ولايته للخلايا الجذعية. وفي الوقت نفسه ، يتم تنظيم كلا الجينات أثناء التمايز وكذلك التعبير عن DSPP حيث زادت العلامة السنية أثناء التمايز. ومع ذلك ، لا يوجد اختلاف كبير في التعبير عن DSVP في الخلايا المتمايزة بين مجموعات ED و OG.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية عزل الخلايا الجذعية لأجزاء الأسنان البشرية باستخدام إما التفكك الأنزيمي لللب أو نمو الخلايا الجذعية من الأنسجة الموسعة. هذا كل شيء. أتمنى لك حظا سعيدا لمحاولة استخدام هذا الإجراء في تجربتك.

شكرا.