العمليات الجراحية لنموذج الفئران من الجزئي زرع الكبد orthotopic مع إعادة الإعمار الكبدي الشرياني

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء عملية زراعة كبد أرثوتوبية جزئية في الجرذان كنموذج تجريبي قابل للتكرار لأبحاث الزراعة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استئصال الكبد من الجرذ المانح، ثم تتمثل الخطوة الثانية في تحضير طعم الكبد خارج الجسم (ex vivo)، بما في ذلك استئصال 50% من الكبد.

بعد ذلك، يتم استئصال الكبد الطبيعي من الجرذ المستقبل. وتتمثل الخطوة النهائية في زراعة طعم الكبد الجزئي في الجرذ المستقبل. وفي الختام، يتم قياس مستويات ناقلة أمين الألانين في المصل لتقييم التلف في الخلايا الكبدية لطعم الكبد بعد عملية الزرع.

بشكل عام، يواجه الأفراد الجدد في تنفيذ هذا الإجراء صعوبة بسبب التعقيد الذي يتطلب مهارات جراحية مجهرية متقدمة. لبدء هذا الإجراء، ضع الجرذ المانح المخدر على وسادة تدفئة بعد التأكد من تخدير الحيوان بالكامل عن طريق قرص إصبع القدم، ثم ثبت الذراعين العلويين باستخدام نظام سحب المثبت المغناطيسي. احلق الفراء من كامل منطقة البطن للجرذ وعقم الجلد المقابل باستخدام محلول بوفيدون يود.

افتح البطن عن طريق إجراء شق في الخط الناصف مع تمديدات ثنائية الجانب. ضع حقنة سعة five milliliter تحت ظهر الجرذ بحيث يتم رفع الوريد الأجوف فوق الكبدي بطنياً باستخدام ملقط mosquito forceps، واسحب العملية باتجاه الرأس وقم بتطبيق المباعدات تحت الضلعية لفتح المجال الجراحي. نظراً للحاجة إلى التعامل المتكرر مع المباعدات والحقنة سعة five milliliter أثناء الإجراء، لا تُستخدم الستائر الجراحية حول الشق. وأثناء العمل تحت مجهر جراحي بتكبير 16 x، قم بتشريح الرباط المنجلي والرباط المثلثي الأيسر ثم افصل الوريد الحجابي الأيسر، وقم بإبعاد الفص الوسطي والفص الجانبي الأيسر للأعلى باستخدام مسحة شاش مبللة.

استخدم ملاقط ثنائية القطب لتخثير وتقسيم الأوعية المجاورة للمريء بين الفص الجانبي الأيسر والفص الإحداثي الأمامي. انقل الأمعاء خارج البطن إلى الجانب الأيسر من الجرذ وغطِّها بقطعة شاش مبللة. استخدم قطعة شاش مبللة لإزاحة الفص الجانبي الأيمن إلى الأعلى.

اعزل الوريد الأجوف下 الكبدي من النسيج خلف الصفاق واربط الوريد الكظري الأيمن، والذي سيتم قطعه لاحقاً قبل إزالة الطعم مباشرة لإدخال دعامة في القناة المرارية، مع ربط القناة المرارية أولاً عند مستوى تفرع الشريان المعدي الاثني عشري. اصنع شقاً صغيراً في الجدار الأمامي للقناة المرارية في المنطقة القريبة من نقطة الربط، ثم أثناء تثبيت الجدار الأمامي للشق بملقط دقيق مستقيم في اليد اليسرى، استخدم ملقطاً دقيقاً منحنيًا في اليد اليمنى لإدخال دعامة في القناة. قم بتثبيتها باستخدام خيط حريري قياس 6-0.

اترك أحد الطرفين المقطوعين للخيط المربوط حول القناة الصفراوية بطول 4 mm حتى يمكن الإمساك بالخيط أثناء عملية المفاغرة اللاحقة. حرر الوريد البابي من الوريدين المساريقي والطحالي عن طريق ربطهما وتقسيمهما، ثم اربط الشريان المعدي الاثني عشري وقسمه. بعد ذلك، اعزل الشريان الكبدي المشترك من رأس البنكرياس وصولاً إلى جذره.

قم بتدوير الكبد جهة اليمين باستخدام مسحات قطنية، ثم قم بتشريح الرباط الموجود حول الجزء الخلفي من الكبد والمريء عند الانتهاء من التحضيرات. ومن أجل استئصال الكبد، قم بإزالة المباعدات، وملقط الجراحة (mosquito forceps) المثبت عند الناتئ الخنجري، والمحقنة سعة 5 mL الموجودة أسفل ظهر الجرذ.

أعد الأمعاء إلى التجويف البطني. احقن 500 IU من heparin natrium في اثنين من milliliters من محلول ملحي طبيعي عبر الوريد القضيبي. بعد حوالي ثلاث دقائق، وباستخدام سرنجة سعة خمسة milliliters، وجفنة mosquito، والمباعد، قم بربط الشريان الكبدي المشترك في منطقة قريبة من جذره.

اترك أحد الطرفين المقطوعين من الخيط مربوطاً للشريان الكبدي المشترك. وبعد فترة طويلة من غلق الوريد الأجوف تحت الكبدي، قم بالإغلاق بالقرب من الوريد الكلوي الأيمن باستخدام ملقط Mosquito.

قم بتثبيت الوريد البابي باستخدام ملقط أوعية دقيقة مخصص للاستخدام مرة واحدة أسفل جذع الوريد الطحالي. قم بشق الجدار الأمامي للوريد البابي وأدخل قسطرة بقياس 18 gauge في الوريد البابي. قم بتروية الكبد في موقعه (in situ) باستخدام 60 milliliters من محلول الهيستيدين والتريبتوفان والكيتوجلوتارات البارد.

عند ضغط هيدروستاتيكي قدره 20 centimeters، يتم قطع الحجاب الحاجز فوراً، وفتح الوريد الأجوف الصدري، والجدار الأمامي للوريد الأجوف تحت الكبدي للسماح بشطف محلول التروية من الكبد. ثبّت الوريد الأجوف تحت الكبدي باستخدام مشبك أوعية دقيقة أسفل الكبد مباشرةً. استأصل الكبد عن طريق تشريح الوريد الأجوف تحت الكبدي.

الوريد البابي، والحجاب الحاجز، والأربطة المتبقية، والوريد الكظري الأيمن، والشريان الكبدي المشترك. ضع الكبد المستأصل في محلول HTK بارد داخل كوب معدني مثبت في صندوق بلاستيكي مملوء بالثلج المجروش. تُجرى إجراءات رقعة الكبد في الكوب المعدني المملوء بمحلول HTK شديد البرودة؛ ولتثبيت غلاف على الوريد البابي، قم بتركيب مشبك DeBakey bulldog على الجذع الوريدي البابي وضع المشبك في وضعية جسرية فوق الكوب.

مرر الوريد البابي من خلال الكم وقم بتثبيت الوريد البابي مرة أخرى مع تمديد الكم عند موضع الساعة 12، ثم اثنِ جدار الوريد البابي فوق الكم لوضع جذع الوريد الطحالي خارج الكم عند موضع الساعة 7، وثبت الوريد البابي بخيط حريري 6-0 لإدخال دعامة في الشريان الكبدي. قم بتثبيت الكبد عن طريق تثبيت كلتا حافتي الحجاب الحاجز بملقط، واسحب الشريان الكبدي المشترك بشكل مستقيم عن طريق إمساك الخيط المربوط باستخدام ملقط DeBakey bulldog ومقص مجهري مستقيم. اصنع شقاً صغيراً في الجدار الأمامي للشريان الكبدي المشترك باستخدام اليد اليسرى.

ثبّت الجدار الأمامي للشق باستخدام ملقط دقيق مستقيم، وبواسطة اليد اليمنى، أدخِل دعامة في الشريان الكبدي المشترك. وباستخدام ملقط دقيق منحني، ثبّت الدعامة بخيط حريري 6-0 مع إبقاء أحد الطرفين المقطوعين من الخيط بطول 4 mm. اغسل الكبد عبر القسطرة الشريانية باستخدام 5 mL من محلول HTK البارد لإجراء استئصال الكبد بنسبة 50%.

أولاً، قم بتثبيت الفص الإحداثي الخلفي باستخدام ملقط جراحي (mosquito forceps) لتثبيته في مكانه. بعد ذلك، قم بربط ساقه باستخدام خيط حريري قياس 4-0، ثم استأصل الفص.

يتم إزالة الفص التاجي الأمامي بنفس الطريقة. بعد ذلك، قم بتدوير الصندوق البلاستيكي بمقدار 90 درجة. قم بتثبيت الحافة اليمنى للحجاب الحاجز والجزء الأيسر من الفص المتوسط.

قم بإجراء شق صغير عند الحافة العلوية لحدود الأجزاء الثنائية من الفص الإنسي، ثم قم بإزالة الجزء الأيسر بعد الربط. بعد ربط السويقة بخيط حريري 4-0، قم بإزالة الفص الجانبي الأيسر، ثم كيّ سطح الكبد المستأصل بعناية باستخدام ملقط ثنائي القطب. وبذلك يتقلص حجم كتلة الكبد بنسبة 50% تقريباً من أجل رتق الوريد الأجوف العلوي الكبدي.

أولاً، قم بتثبيت وضع الكبد عن طريق تثبيت كلا حافتي الحجاب الحاجز باستخدام ملقط الجراحي (mosquito forceps). ثم قم بتشذيب الجدار الأمامي للوريد الأجوف العلوي فوق الكبدي عن طريق إزالة جزء الحجاب الحاجز المقابل. قم بتثبيت غرز بولي بروبيلين 2 7 0 من الخارج إلى الداخل في كلا الزاويتين كغرز تثبيت من أجل المفاغرة اللاحقة.

بعد ذلك، قم بتقليم الجدار الخلفي للوريد الأجوف العلوي الكبدي. احفظ طعم الكبد عند درجة حرارة 4 °C في محلول HTK داخل حمام مائي بارد. جهز المستقبل للجراحة بنفس الطريقة المتبعة في عملية المتبرع، وافتح البطن عن طريق شق في خط المنتصف.

ضع مسحة شاش مبللة فوق الجانب الأيمن من الاثني عشر والأمعاء بأكملها. للحصول على مجال جراحي حول الوريد الأجوف تحت الكبدي، ضع الفصوص الجانبية والوسطى اليسرى في التجويف تحت الحجابي الأيسر، وقم بإزاحة الفص الجانبي الأيمن للأعلى باستخدام مسحة شاش مبللة.

قم بعزل الوريد الأجوف تحت الكبدي من الأنسجة خلف البريتونية الملحقة، ثم اربط الوريد الكظري الأيمن واقطعه باستخدام الشاش المبلل ومسحات القطن. أدر الكبد جهة اليسار وقم بتشريح الرباط الموجود خلف الكبد. اقطع القناة الصفراوية أسفل الفرع الخارج من الفص المذيل مباشرة.

احتفظ بإحدى النهايات المقطوعة من الخيط مربوطة للقناة الصفراوية بطول 4 mm. اربط الشريان المعدي الاثني عشري والشريان الكبدي السوي واقطعهما على مسافة 3 mm من نقطة تفرعهما عن الشريان الكبدي المشترك، وذلك لإنشاء بنية شريانية واسعة عند نهاية الشريان الكبدي المشترك. قم بتثبيت الوريد الأجوف تحت الكبدي باستخدام ملقط أوعية دقيقة معدني فوق الوريد الكلوي الأيمن مباشرة، وثبّت الوريد البابي عند مستوى تفرعه في سرة الكبد باستخدام ملقط mosquito. اربط الوريد الأجوف فوق الكبدي مع الحجاب الحاجز باستخدام ملقط أوعية محيطية، وثبّت الملقط في قطعة من الصلصال الزيتي. خفّض التخدير باستخدام isof fluorine إلى 0.4% حجماً. استأصل الكبد الأصلي للمستقبل عن طريق تشريح الوريد الأجوف فوق الكبدي عند الحد الفاصل بين الوريد الأجوف فوق الكبدي والكبد.

الوريد البابي فوق فكي ملقط البعوض مباشرة، والوريد الأجوف تحت الكبدي أسفل نقطة المنتصف قليلاً بين الكبد والوريد الكلوي الأيمن. يتم وضع طعم الكبد في موضعه التشريحي الأصلي. وتعد عملية إعادة بناء الأوعية الدموية الجزء الأكثر صعوبة وأهمية في هذا الإجراء.

يجب تنفيذ ذلك بدقة شديدة وبسرعة في الوقت ذاته لإجراء المفاغرة للوريد الأجوف فوق الكبدي بواسطة غرزة مستمرة. يتم وضع غرزة التثبيت في الوريد الأجوف فوق الكبدي للمستقبل من الداخل إلى الخارج باستخدام خيط البولي بروبيلين 7-0 المرفق عند الزاوية اليمنى من الطعم، يلي ذلك ربط عقدة بالطريقة نفسها. ثم توضع غرزة التثبيت الثانية عند الزاوية اليسرى.

ستكون هذه الغرزة هي الغرزة المبدئية لخياطة مستمرة. ولتوسيع المفاغرة، أمسك الغرز وثبتها باستخدام ملاقط "دي باكاي" (DeBakey bulldog clamps) عند كلا الزاويتين مع سحبها بلطف نحو الأعلى جانبياً. بعد ذلك، قم بتمرير الإبرة في الغرزة عند الزاوية اليسرى عبر جدار جانب الطعم من الخارج إلى الداخل بالقرب من العقدة الخارجية، ثم خيط الصف الخلفي من الوريد الأجوف السفلي (satic vena caver) داخل اللمعة بسبع إلى ثماني غرز وصولاً إلى الزاوية اليمنى.

قم بإجراء الغرز القليلة الأولى بعناية بحيث تتقابل التجاويف الداخلية عند الزاوية الصحيحة. مرر خيط البولي بروبيلين 7-0 عبر الوعاء من جهة الرقعة إلى الخارج. خِط الصف الأمامي من الخارج من اليمين إلى اليسار بنحو 10 غرز.

قم بشطف الجزء الداخلي بمحلول رينجر اللاكتات. ولإزالة فقاعات الهواء، اجعل الغرزة الأخيرة قريبة من غرزة التثبيت، ثم اربطهما معاً. ولإعادة بناء الوريد البابي، قم بضغط الوريد البابي باستخدام ملقط أوعية دقيقة، وثبّت ملقط البعوض (mosquito forceps) في الصلصال. بعد ذلك، قم بشق الجدار الأمامي للوريد البابي أسفل فك ملقط البعوض مباشرة.

اغسل الجزء الداخلي من الوريد البابي المستقبِل والكم باستخدام محلول رينجر اللاكتاتي. أدخل الكم في الوريد البابي وثبته بخيط حريري قياس 6-0 بشكل محيطي. وأخيراً، أعد تروية الكبد.

قم بإزالة سرنجة الخمسة مليلتر من ظهر الجرذ وزد تركيز isof fluorine إلى 0.8% حجماً لإعادة بناء الكبد باستخدام تقنية الدعامة. أولاً، أمسك خيط الشريان الكبدي المناسب باستخدام ملقط mosquito وثبته في الصلصال. ثم قم بغلق الشريان الكبدي العام للمستقبل.

قم بإجراء شق صغير في تفرع هيكل Y عند نهاية الشريان الكبدي العام لعمل فتحة على شكل قمع. أمسك بالدعامة الموضوعة في الشريان الكبدي العام للرقعة باستخدام ملقط دقيق منحني. قم بتمرير الدعامة داخل الشريان الكبدي العام للمستقبل وثبتها بربطة من خيط حريري six zero. اربط أحد طرفي هذا الخيط مع الخيط الذي يبلغ طوله أربعة ملليمترات في الشريان الكبدي العام للرقعة معًا، بحيث يتقارب الشريانان الكبديان العامان مع تقليل التوتر في موقع التوصيل.

بعد ذلك، قم بتحرير مشبك الوريد الأجوف تحت الكبدي لإجراء المفاغرة عن طريق خياطة مستمرة بنفس طريقة الوريد الأجوف فوق الكبدي، ولكن مع استخدام غرز أكثر وبمقاطع أدق. بعد إزالة المشابك، قم بزيادة تركيز التخدير إلى 1.0% حجماً لإعادة بناء القناة الصفراوية. أمسك بخيط القناة الصفراوية للمستقبل باستخدام ملقط ملقط (mosquito forceps) وثبته في الصلصال.

أجرِ شقاً صغيراً في القناة الصفراوية عند المستوى المناسب لضمان عدم زيادة طول القناة الصفراوية المعاد بناؤها. أدخل الدعامة وثبتها بخيط حريري عيار 6-0. اربط هذا الخيط مع الخيط الموجود في القناة المطعمة.

بهذا تكون جميع إجراءات إعادة البناء قد اكتملت. أغلق الشق البطني باستخدام غرز Vicryl 4-0 مستمرة على شكل طبقات. مباشرة بعد العملية، عالج الجرذ المستقبل بحقنة تحت الجلد من sphero sodium وbuprenorphine في إجمالي 1.5 milliliters من محلول saline الملحى العادي.

اترك الجرذ ليتعافى لمدة 60 دقيقة في قفص وحدة عناية مركزة خاصة مزود بهواء دافئ وإمدادات أكسجين قبل إعادته إلى قفص عادي. بقيت جميع الجرذان المستقبلة على قيد الحياة حتى الموت الرحيم المخطط له لأخذ عينات الدم عند 1 و3 و24 و168 ساعة بعد إعادة التروية البابية. وتم تحليل عينات المصل لقياس مستويات alanine aminotransferase التي تعكس درجة التلف في الخلايا الكبدية للطعوم الكبدية بعد الزرع.

كما هو موضح في هذا الرسم البياني، وصلت مستويات LT إلى ذروتها عند 24 ساعة ثم انخفضت إلى الحدود الطبيعية في غضون 168 ساعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء زراعة الكبد الموضعية الجزئية في الجرذان كنموذج تجريبي قابل للتكرار لأبحاث الزراعة.