تشريح والثقافة، وتحليل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير مزرعة خلايا أولية لخلايا شبكية Xenopus. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة للكشف عن الشبكية، وتتمثل الخطوة الثانية في استئصال نسيج الشبكية.

بعد ذلك، يتم تفكيك أنسجة الشبكية إلى خلايا مفردة. وتتمثل الخطوة النهائية في زراعة خلايا الشبكية في طبق UnCloned وإضافة flu oh 4:00 AM للتصوير الكالسيومي. وفي النهاية، يُستخدم المجهر البؤري للكشف عن نشاط الكالسيوم في مزرعة خلايا الشبكية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات البيولوجيا التنموية، والبيولوجيا العصبية، وبيولوجيا الخلية، مثل دور الكالسيوم والنشاط الكهربائي في تطور الشبكية، بالإضافة إلى التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذا الإجراء بعض الصعوبات لأن الحركات الحركية الدقيقة ضرورية لإجراء عمليات التشريح في الوقت المناسب وبدقة. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة خطوات التشريح التي تتطلب حركات دقيقة ومنسقة بين اليد والعين.

لبدء هذا الإجراء داخل غطاء التدفق الصفائحي، قم بتحضير وتسمية ما يلي: طبق بتري بلاستيكي واحد بقطر 60 مليمتر يحتوي على 10 مليلتر من وسط استزراع الخلايا ليُستخدم كطبق للتشريح. واختياريًا، يمكن إضافة 10 مليغرام من collagenase B إلى طبق التشريح للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1.0 مليغرام لكل مليلتر للمساعدة في فصل طبقات الأنسجة عند تشريح الأجنة في المرحلة 25 أو أقل.

قم أيضاً بتجهيز طبق سطح زراعة بقطر 35 مليمتر يحتوي على 2 مليلتر من وسط زراعة الخلايا لاستخدامه كطبق زراعة، وأنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 مليلتر لاستخدامه كأنبوب لتفكيك المستأصلات، وأنبوب فالكون مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على 15 مليلتر.

وسط زراعة الخلايا. بعد ذلك، يتم تحضير طبقين بلاستيكيين من أطباق بتري بقطر 35 ملم، يحتوي كل منهما على 2 مل من وسط CMF لعملية التشريح، بحيث يُستخدم أحدهما كطبق لتفكيك الجزء المستأصل، والآخر كطبق لشطف الجزء المستأصل خارج غطاء التدفق الصفائحي. يتم تحضير طبقين بلاستيكيين من أطباق بتري بقطر 60 ملم، يحتوي كل منهما على 10 مل.

0.1 XMMR، يُستخدم أحدهما كصفيحة تثبيت، والآخر كصفيحة شقيقة، وصحن بتري بلاستيكي إضافي بقطر 60 مليمتر يحتوي على 10 مليلتر من 0.1 XMMR مضافاً إليه 0.5 مليجرام لكل مليلتر من MS 2 22. بعد ذلك، أضف 40 ميكرولتر من 5%tripsin في CMF إلى صفيحة تفكيك المستنبت.

قم بالتحريك لخلط المكونات، ثم اتركها جانباً. بعد ذلك، ابدأ بعملية التشريح باستخدام مجهر تشريحي، مع استخدام زوجين من الملاقط الدقيقة. قم بإجراء قطع سهمي متوسط في الجانب البطني للجنين، بدءاً من الطرف الخلفي، ومستمراً عبر الغدة الأسمنتية في الجزء الأمامي من الجنين.

افتح الجنين بعناية عن طريق مباعدة جانبي الشق، بحيث يكون الجانب الظهري للجنين مواجهاً لصفيحة التشريح. بعد ذلك، افتح الأديم الظاهر البطني للكشف عن الأديم الباطن والأديم المتوسط.

بعد ذلك، قم بإزالة الأديم الباطن والأديم المتوسط، وهما الطبقة الأولى والأكبر من هذا النسيج. يتميز الأديم الباطن بمظهر زغبي للغاية مع خلايا كبيرة وتنظيم غير واضح. بعد إزالة هذه الطبقة، ستصبح السوميتات وNoor مرئيتين.

لتحقيق تباين أفضل، انقل الجنين إلى طبق بتري بلاستيكي منفصل بحجم 60 مليمتر يحتوي على 10 مليلتر من وسط زراعة الخلايا، و100 ميكرولتر من محلول Nile blue sulfate بتركيز 1%، ثم اتركه في الحاضنة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك، انقله مرة أخرى إلى لوح التشريح. ستعمل هذه العملية على صبغ الأديم الظاهر والقطع الجسمية والـ Noor لتسهيل عملية التعرف والتوجيه.

بالتركيز على الجزء الأمامي من الجنين، قم بإزالة النور (Noor) وأي ميزوديرم متبقٍ بعناية للكشف عن الدماغ والحويصلات البصرية. وبمجرد الكشف تماماً عن الدماغ والحويصلات البصرية، استخدم الملقط لقطع الأنبوب العصبي والإكتوديرم الموجود تحته مباشرة خلف الدماغ. اقلب هذا الجزء بحيث يكون الإكتوديرم في الأعلى.

توخَّ الحذر لتجنب إتلاف الحويصلات البصرية الكامنة وقم بإزالة الأديم الظاهر بعناية. وأخيرًا، افصل الحويصلات البصرية عن الدماغ باستخدام الملقط عند تشريح جنين يتجاوز المرحلة 25. أولًا، قم بإزالة الجزء البطني من الجنين باستخدام الملقط في لوحة التخدير.

لتحسين التباين، انقل الجنين إلى طبق بتري بلاستيكي بقطر 60 مليمتر يحتوي على 10 مليلتر من 0.1 XMMR و100 ميكرولتر من 1% Nile blue sulfate لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لصبغ الأديم الظاهر. بعد ذلك، انقله إلى لوحة التشريح. ثم، مع تثبيت الجنين في مكانه، قم بإزالة الشبكية أو الحويصلة البصرية التي تقع مباشرة أسفل الأديم الظاهر المغطي لها بعناية.

بمجرد تشريح الحويصلة البصرية أو الشبكية، انقلها بعناية إلى طبق شطف العينات X باستخدام ماصة دقيقة P 100 ذات رأس مقاوم للرذاذ. احرص على عدم السماح للعينة بملامسة أي حدود فاصلة بين الهواء والسائل. ثم اترك العينة لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك، انقل 80 µL من 0.1%trypsin في CMF من طبق تفكيك العينة إلى أنبوب تفكيك العينة. بعد ذلك، انقل الشبكية أو الحويصلة البصرية من طبق شطف العينة إلى أنبوب تفكيك العينة، مع تجنب نقل محلول شطف العينة.

بعد ذلك، اترك النسيج ليتفكك في أنبوب تفكيك المستأصل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. إذا كان سيتم التقاط صور متعددة للخلايا طوال التجربة، قم بتثبيت شبكة في الجانب السفلي من طبق الزرع باستخدام قطرات صغيرة من الغراء السريع (super glue). سيتيح ذلك التقاط صور لخلايا متطابقة وفي اتجاهات متماثلة في نقاط مختلفة من إجراء زرع الخلايا.

أولاً، قم بإزالة 40 µL من المحلول ببطء من أنبوب تفكيك الموضحات وتخلص منها. بعد ذلك، استخدم الماصة P 100 المزودة بطرف مقاوم للرذاذ لنقل الخلايا ببطء إلى طبق الزرع. عند سحب الخلايا إلى الطبق، قم بالماصة ببطء وحافظ على وجود الخلايا في منطقة صغيرة في مركز الطبق.

يوضح هذا الشكل مثالاً لنشاط الكالسيوم في خلية واحدة على مدار ساعة واحدة من التصوير. وتقدم هذه الأشكال النتائج التمثيلية لتجارب تصوير الكالسيوم في خلايا الشبكية الجنينية كما تم تحليلها في مراحل نمائية مختلفة. وباختصار، تظهر النتائج أن الكالسيوم منظم نمائياً مع وجود قمم تذبذبية في المرحلة 35 من حيث ربط نشاط الكالسيوم بالخلايا الإيجابية لمسبار محدد.

في تجارب الأسماك، ورغم عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية، لوحظ وجود اتجاه يشير إلى أن الخلايا الإيجابية لعلامة GABAergic تظهر مستويات أعلى من نشاط تدفق الكالسيوم (calcium spiking) مقارنة بالخلايا الإيجابية لعلامة glutamatergic أو لتشفير جين PT F1 A.A، وهو عامل نسخ يرتبط بتعزيز النمط الظاهري GABAergic. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في حوالي ثلاث ساعات و30 دقيقة للطبق الواحد إذا نُفذت بشكل صحيح. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل زراعة الخلايا أو التهجين C two أو التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد الخلايا التي تعبر عن علامات نمط ظاهري محددة أو لتحليل التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تشريح أنسجة الشبكية، وفصل أنسجة الشبكية، وزراعة خلايا الشبكية في أطباق.