الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

الهدف من الإصلاح من هذا الإجراء هو إظهار الضبط اليومي المناسب وتحليل العينة على أداة CyTOF. أولا ، يتم تجميع الجهاز وتشغيله. بعد ذلك ، تم تحسين إعدادات الجهاز لضبط الحد الأقصى للإشارة.

ثم تكون الآلة جاهزة لتشغيل العينات. في الخطوة الأخيرة ، يتم تنظيف الجهاز وإيقاف تشغيله. في النهاية ، يمكن الحصول على بيانات الخلية المثلى وفقا لمتطلبات الوقت المحددة.

العرض المرئي لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية. يصعب تعلم إجراءات الإعداد والضبط والتنظيف اليومية من الدليل. نظرا لوجود العديد من خطوات البرامج المتزامنة المتضمنة.

تحتاج إلى اكتساب الخبرة لاكتساب شعور بمستويات الخلفية المناسبة وشدة الإشارة قبل 15 دقيقة على الأقل من بدء التجربة. افتح برنامج CyTOF وحدد إعداد الأداة. ثم في علامة تبويب قفص البطاقة ، انقر فوق زر تشغيل السخان للسماح لغطاء غرفة الرش بالوصول إلى 200 درجة مئوية.

استبدل المحقنة الموجودة في مضخة الحقنة بحقنة جديدة مملوءة بماء مكعب مللي. ثم قم بتنظيف البخاخات عن طريق التنظيف الخلفي باستخدام 5٪ Citron مرتين من خلال منفذ الوصول. لإزالة أي بقايا من السترون ، كرر التدفق الخلفي بماء Milli Q.

بعد ذلك ، افتح صمام خزان غاز الأرجون مما يؤدي إلى تشغيل ضوء الأرجون في مقدمة الماكينة. ثم قم بتوصيل البخاخات بمدخل غاز المكياج وقم بتوصيل البخاخات بأنبوب إدخال السائل. أدخل طرف البخاخات في الفتحة البيضاء في عباءة التسخين على علامة تبويب وحدة التحكم RFG في نافذة إعداد الجهاز

انقر فوق بدء البلازما، ثم انقر فوق موافق. بعد انتهاء بدء التشغيل ، انقر فوق موافق مرة أخرى في النافذة المنبثقة. الآن قم بتشغيل مضخة الحقنة.

عند إعادة تعبئة المحقنة ، اضغط على زر الإيقاف بدلا من زر الإيقاف المؤقت لإعادة ضبط عداد الصوت قبل معايرة مقياس الكتلة الخلوي ، تأكد من تسخينه لمدة 20 دقيقة. بمجرد استقرار الجهاز، انقر فوق زر إعدادات الاكتساب لفتح نافذة إعدادات الحصول على البيانات. في علامة التبويب التحليلات.

انقر فوق الجدول الدوري لفتح لوحة اختيار النظائر. ثم حدد النظائر في حل ضبط علوم DVS المدرج في الدليل وانقر فوق حفظ. بعد ذلك ، انقر فوق النظائر لكل زر قراءة لفتح الكتل لكل نافذة قراءة.

حدد عدد النبضات وأعد قياس المحور y عن طريق إدخال رقم جديد ثم الضغط على Enter. الآن ملء معيار واحد مليلتر الأخضر حقنة حقنة مع حل ضبط. أدر محدد منفذ العينة للتحميل.

بحقن 450 ميكرولتر من محلول الضبط ، ثم أدر المحدد للحقن. انتظر حتى تبدأ نظائر محلول الضبط في الظهور كخطوط في هذه الشاشة. الإشارات في وقت الرحلة ، 9 ، 400 إلى 9 ، 800 منطقة ترجع إلى نظائر الزينون في غاز الأرجون.

عد الآن إلى الجماهير لكل نافذة قراءة وانقر فوق زر التشغيل الأخضر. يمثل كل خط ملون نظائر مختارة من علامة تبويب التحليلات. عندما تكون مستويات النظائر ثابتة، قم بضبط تيار التحديد الحالي من القائمة المنسدلة في علامة تبويب المعلمات في نافذة إعدادات الحصول على البيانات.

في نافذة البداية ، أدخل صفرا للإنهاء ، وأدخل 10. بالنسبة لقيمة الخطوة، أدخل 0.5، وبالنسبة لوقت السوية، أدخل 200. ثم انقر فوق حفظ.

ثم انقر مرة أخرى على الكتل لكل نافذة قراءة وانقر فوق تشغيل. بعد ملاحظة مكان ذروة إشارات النظائر ، انتقل إلى علامة التبويب إعداد قناة DAC في نافذة إعداد الأداة. قم بالتمرير لأسفل إلى التيار وأدخل قيمة ذروة النظير.

انقر فوق تعيين القيمة الحالية الفعلية، ثم حفظ. بعد ذلك ، قم بتغيير القائمة المنسدلة لتعويض الغاز. أدخل 0.55 في نافذة البداية و 0.95 في نافذة النهاية و 0.05 في نافذة قيمة الخطوة و 200 في نافذة وقت التسوية.

انقر على حفظ. بعد العودة إلى الكتل في نافذة القراءة والنقر فوق تشغيل مرة أخرى ، سيعرض المحور x الآن معدل تدفق غاز المكياج. لاحظ القيم التي تصل فيها إشارات النظائر إلى ذروتها ولاحظ الزيادة السريعة لإشارة GD 1 55 بالقرب من النهاية.

ثم ارجع إلى علامة التبويب إعداد قناة DAC. قم بالتمرير لأسفل إلى المكياج والغاز وأدخل قيمة ذروة النظير الجديدة. انقر فوق تعيين القيمة الحالية الفعلية.

ثم انقر فوق حفظ مرة أخرى لتسجيل نسبة النظير المطلوب مقابل الأكسيد. أولا ، قم بعمل حقن ثان بسعة 450 ميكرولتر من محلول الضبط. ثم في علامة تبويب المعلمة ، حدد الوقت من القائمة المنسدلة وأدخل صفرا في نافذة البداية ، و 10 في نافذة النهاية ، و واحد في نافذة قيمة الخطوة ، و 200 في نافذة التسوية.

بعد النقر فوق تشغيل في الكتل لكل نافذة قراءة ، استخدم المؤشر لقراءة القيمة الأعلى ل TM 1 69 أو TB 1 59 ، وكذلك قيمة GD 1 55. الآن قم بحقن ثلاثة ملليلتر من ماء Milli Q من خلال حلقة العينة ، متبوعا ب 500 ميكرولتر من محلول غسيل DVS. في علامة تبويب المعايرة الجماعية، انقر فوق تشغيل لمراقبة تقدم غسل التنظيف حتى تبدأ شدة الخطوط في الانخفاض.

ثم اتبع بثلاثة ملليلتر من ماء مكعب ملي وراقب حتى تنخفض الخطوط إلى مستويات الخلفية. ابدأ بإدخال عينة النظائر الموضحة للتو لنظائر محلول الضبط ، ثم انقر فوق حفظ. بعد ذلك، افتح نافذة الاكتساب وقم بتغيير إعدادات الاكتساب حسب الحاجة لحجم العينة.

على سبيل المثال ، ستملأ عينة سعة 450 ميكرولتر حلقة العينة وتستغرق 600 ثانية للتشغيل للسماح بالتأخير في الحصول على بيانات الخلية. اضبط تأخير الاستحواذ على 30 ثانية على الأقل وتأخير ثبات الكاشف على 20 ثانية على الأقل قبل التشغيل. اغسل عينات الخلية مرتين على الأقل بماء مكعب ملي ، ثم أعد تعليق العينة بحد أقصى 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر وقم بتصفية محلول الخلية الناتج من خلال مصفاة خلية 35 ميكرومتر.

لإزالة أي تجميعات. أدخل الآن اسم ملف جديد للنموذج الحالي. لاحظ أنه يجب حفظ جميع الملفات على محرك الأقراص الإلكتروني.

ثم قم بتبديل صمام حلقة العينة للتحميل ، وحقن العينة ، وقم بتبديل صمام حلقة العينة مرة أخرى للحقن ، ثم انقر فوق تشغيل. في نافذة الاستحواذ. سيتم تمثيل الخلايا في نافذة اللقطة كمجموعات أفقية من العلامات في كل قناة نظير رأسي وستعرض أفضل دقة تتراوح بين 300 و 500 خلية في الثانية كما هو موضح هنا.

عند الانتهاء من الحصول على بيانات العينة ، ستظهر نافذة منبثقة. انقر فوق موافق لتأكيد اكتمال تشغيل العينة ، ثم قم بحقن ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من ماء MQ بين كل عينة للمساعدة في تقليل أي عملية ترحيل للعينة لتنظيف الماكينة بعد الاستخدام ، قم بحقن 450 ميكرولتر من محلول الغسيل في حلقة العينة. راقب إطلاق المعدن الحر ثم اغسل حلقة العينة بثلاثة ملليلتر من ماء مللي Q لمراقبة الغسيل حتى يتم تحقيق مستويات خط الخلفية.

ثم لإيقاف تشغيل الجهاز ، حدد علامة التبويب وحدة تحكم RFG في نافذة إعداد الجهاز وانقر فوق إيقاف البلازما. عند اكتمال الإجراء ، انقر فوق موافق في النافذة المنبثقة ، مع التوصية بإزالة البخاخات أسفل علامة تبويب قفص البطاقة. قم بإيقاف تشغيل السخان ، وأغلق الصمام الموجود على مصدر الأرجون ، ثم اسحب البخاخات للخلف بحذر لإزالته من غرفة الرش.

بعد ذلك ، قم بفك أنبوب إدخال العينة وضعه جانبا. قم بفك وصلة إدخال غاز المكياج حتى ترتخي قليلا ، ثم اسحب البخاخات. أخيرا ، باستخدام نفس المحقنة والأنبوب كما هو موضح سابقا ، قم بتنظيف كلا منفذي البخاخات باستخدام 5٪ Citron وقم بتخزين البخاخات المغطاة ب 5٪ Citron حتى الاستخدام التالي.

سيؤدي الغسيل الكافي لمقياس الكتلة الخلوي بماء UE ومحلول غسيل DVS إلى تقليل مستويات امتصاص المعادن للأنبوب وأجزاء أخرى من الماكينة مما يساعد على تقليل أي خلفية كما هو موضح في هذه الرسوم البيانية. أدى الضبط غير الصحيح الذي يمثله الخط الأرجواني إلى زيادة تكوين الأكسيد بشكل كبير عند m زائد 16 مقارنة بالعينة المضبوطة بشكل صحيح كما يتضح من الخط الأزرق الداكن. هذا له تأثير في تقليل الإشارات المطلوبة بشكل طفيف عند m وزيادة كبيرة في تداخل الخلفية غير المرغوب فيه عند m زائد 16.

سيضمن الغسيل السليم والتخفيف المناسب للعينات في ماء Milli Q الحد الأدنى من الخلفية وأكبر دقة للخلايا مع موازنة الحاجة إلى السرعة. على غرار البيانات من تجربة تمثيلية موضحة هنا في هذه التجربة ، تم تشغيل حبات البوليسترين التي تحتوي على وفرة طبيعية من اللانثانم 1 39 ، وأوديوم واحد 40 ، و TERBIUM 1 59 ، و DIUM 1 69 ، و LUTETIUM 1 75 في وضع اكتساب الخلية. تم تحليل البيانات باستخدام FlowJo وتم إخراج الحطام من أي حبات مكسورة.

تم تحديد العينة المضبوطة بشكل صحيح لتكون بمعدل تدفق 0.74 لتر في الدقيقة كما هو ممثل بالخط الأزرق الداكن. لوحظت شدة إشارة أعلى عند معدل التدفق هذا مقارنة بمعدلات التدفق المنخفضة ، ولوحظ أن هذه العينة المضبوطة بشكل صحيح تحتوي على إشارة أعلى عند الكتل المعدنية M وإشارة أقل عند m بالإضافة إلى 16 كتلة أكسيد من الإشارات المضبوطة بشكل غير صحيح. تظهر هنا لقطة مقربة للإشارة في M Mass LANTHANUM 1 39 و THULIUM 1 69.

لاحظ أن معدل تدفق غاز المكياج يؤثر على شدة إشارة LANTHANUM 1 39 أكثر من شدة إشارة الثوليوم 1 69. توضح هذه الرسوم البيانية الإشارة عند m زائد 16 كتلة أكسيد 1 55 و 180 5 المقابلة ل LANTHANUM 1 39 زائد oh 16 و thulium 1 69 زائد أوه 16 أكاسيد على التوالي. لاحظ أن معدل تدفق غاز المكياج يزيد من إشارة الكتلة 1 55 أكثر بكثير من إشارة الكتلة 180 5 حيث يتأكسد اللانثانم 1 39 بسهولة أكبر من الثوليوم 1 69.

تصوير شدة الإشارة m و m زائد 16 كدالة لمعدل تدفق غاز المكياج هنا. تمثل الرموز المملوءة MASS M ، بينما تمثل الرموز المفتوحة الكتلة M زائد 16 ، فإن ألوان الخطوط تتوافق مع الكتلة المعنية M.لاحظ أن شدة إشارة LANTHANUM 1 39 وسعر ODIUM 1 41 تتأثر بشدة بمعدل تدفق غاز المكياج. حتى الوصول إلى نقطة توجد فيها كتلة m زائد 16 أكسيد أكثر من الكتلة M ، بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بدء تشغيل CyTOF بشكل صحيح ، ثم تشغيل العينات الخاصة بك ، وأخيرا تنظيف الجهاز وإغلاقه بشكل صحيح في نهاية عمليات التشغيل اليومية.