تحقيقات بشأن التعديلات من وظيفة الدائرة الحصين عقب معتدل إصابات في الدماغ

الهدف العام من التجربة التالية هو استقصاء التغيرات في وظيفة الشبكة العصبية لمناطق الدماغ المتأثرة بنموذج تجريبي لإصابة الدماغ الرضحي الخفيفة. تبدأ التجارب بإحداث إصابة جانبية بنبض السوائل في فأر، وهو ما يحاكي كلًا من الاعتلال المرضي والأعراض السريرية لإصابة الدماغ الرضحي الخفيفة لدى البشر. وفي خطوة ثانية، يُستخدم استجابة الخوف الشرطي السياقي، وهو سلوك يعتمد على الحصين، لتقييم القصور المعرفي الناجم عن إصابة الدماغ. بعد ذلك، تُستخدم التسجيلات خارج الخلوية وداخل الخلوية جنبًا إلى جنب مع الأصباغ الحساسة للجهد لتحديد التغيرات المحددة إقليميًا في التوازن المشبكي بين النقل المشبكي الاستثاري والتثبيطي. وفي المنطقة المستهدفة، وهي الحصين، تظهر النتائج تغيرات محددة في المناطق الفرعية لفعالية المشابك الصافية في الحصين بناءً على الاختلافات بين الفئران الضابطة والفئران المصابة في الدماغ عبر تقنيات التسجيل الثلاث الموصوفة.

تكمن الميزة الرئيسية لهذا النهج في القدرة على تمييز تأثيرات كل من الحالة المرضية والعلاجات المحتملة على مقاييس فسيولوجية متعددة، مما يتيح صورة أكثر تماسكاً لعجز هذه الدائرة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية حول إصابة الدماغ الرضحيّة، مثل تحديد أي الخلايا العصبية هي الأكثر عرضة للإصابة تحديداً، وبالتالي الأكثر مساهمة في خلل وظائف الحصين بعد الإصابة. وتمتد تداعيات نهجنا نحو علاج إصابة الدماغ الرضحيّة، حيث يتيح لنا أولاً تحديد الآليات الكامنة، ثم تطوير علاجات محتملة لاستعادة الفسيولوجيا الطبيعية في المناطق المتضررة من إصابة الدماغ.

في هذا الإجراء، يتم تخدير الفأر باستخدام خليط من ketamine و xylazine يُعطى عن طريق الحقن داخل الصفاق. بعد ذلك، يتم إجراء عملية استئصال عظمي (craniectomy) على شكل حرف C فوق المنطقة الجدارية اليمنى باستخدام مثقاب بقطر خارجي يبلغ 3 mm. ثم يتم تثبيت قاعدة إبرة lute lock فوق منطقة الاستئصال العظمي باستخدام cyanoacrylate وأكريليك الأسنان.

بعد مرور 24 ساعة، يتم تخدير الفأر باستخدام isof fluorine عن طريق الاستنشاق. وبمجرد استعادة التنفس الطبيعي، وقبل أن يصبح الفأر حساساً للتحفيز، يتم توجيه نبضة من المحلول الملحي لمدة 20 millisecond إلى الجمجمة عبر جهاز إصابة الارتطام السائل. يتم إزالة المحور فوراً بعد الإصابة. بعد ذلك، يتم إعادة تخدير الفأر باستخدام isof fluorine وخياطة فروة الرأس.

قم بالتعامل مع الفأر في يومين متتاليين قبل التدريب على استجابة الخوف الشرطية. وفي يوم التدريب، ضع الفأر في غرفة الإشراط لمدة ثلاث دقائق قبل إعطائه صدمة أرضية بقوة 1.5 amp لمدة ثانيتين. ثم اترك الفأر في الغرفة لمدة 30 ثانية إضافية قبل إخراجه.

بعد فترة انتظار مدتها 24 ساعة، يُعاد الفأر إلى غرفة التكييف لمدة خمس دقائق، ثم يتم تقييم التجمد في فترات زمنية مدتها خمس ثوانٍ بعد سبعة أيام من الإصابة. يتم تحضير لتر واحد من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي و 250 ملليلتر من محلول قطع السكروز. تأكد من أن جميع الأدوات والمحاليل المستخدمة أثناء تحضير شرائح الدماغ مبردة بالثلج.

قم بتخدير الفأر باستخدام isof fluorine بسرعة وبلطف. استأصل الدماغ من الفأر وضعه في محلول sucrose. بعد ذلك، قم بتقليم الدماغ.

ضع سطح الدماغ المقطع حديثاً على قطرة من الغراء السريع (superglue) على منصة Vibram أمام كتلة من الآجار. قم بقطع شرائح إكليلية بسمك 350 micron. يجب أن تكون قادراً على الحصول على أربع أو خمس شرائح تحتوي على دائرة حصين (hippocampal circuit) سليمة.

بعد ذلك، يتم تحضين الشرائح لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية. والآن، يتم تحضير بعض الأقطاب الكهربائية المصنوعة من زجاج البوروسيليكات بمقاومة تتراوح بين 2 إلى 5 ميجا أوم. وباستخدام الساحب العمودي، يتم نقل شريحة إلى الغرفة، ثم يوضع القطب الكهربائي على حامل الأقطاب لتسجيل جهد المجال خارج الخلوي.

ضع القطب المحفز فوق المسار المحواري في الشريحة، مثل المسار الشوكي أو شعيرات شافر الجانبية. ثم استمر في خفض قطب التسجيل داخل الشريحة. بعد ذلك، قم بتسليط نبضة كهربائية واحدة لاستحثاث جهد ما بعد التشابك خارج الخلية الميداني.

استمر في التحفيز مع تغيير عمق قطب التسجيل بين المحفزات حتى يتم الوصول إلى الاستجابة القصوى. يعد ذلك مؤشراً على أن الأقطاب في نفس المستوى. يتكون تحليل المستوى Z عادةً من قياسات تقارن سعة التصريف الليفي (fiber volley) في كل من الفئران المصابة بإصابات دماغية والفئران التي خضعت لعملية وهمية لتقييم التنشيط قبل التشابكي، بالإضافة إلى مقارنة منحدر جهد ما بعد التشابك الميداني (F-E-P-S-P) لتقييم التنشيط بعد التشابكي. بالنسبة لتسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp)، انقل شريحة أخرى إلى الحجرة ثم اخفض قطب التسجيل.

اقترب من الخلية مع تطبيق ضغط إيجابي على القطب لضمان عدم انسداد قطب التسجيل أثناء تحركه لأسفل عبر النسيج. وعندما يلامس القطب الخلية برفق، طبق ضغطاً سلبياً لإنشاء سد غيغاسيل (giga seal) بين القطب والغشاء البلازمي. بعد ذلك، طبق نبضات قصيرة من الضغط السلبي لتمزيق الغشاء البلازمي بهدف الوصول إلى تهيئة الخلية الكاملة (whole cell configuration).

قم بإزالة العابر السعوي باستخدام المضخم وعوّض المقاومة التسلسلية لضمان دقة القياسات. ثم قم بقياس ومقارنة معدل وحجم التيارات التشابكية التلقائية في كل من الفئران المصابة بإصابة دماغية ومجموعات التحكم التي خضعت لعملية وهمية. في هذه الخطوة، قم بتحضير المخزون المركز للصبغة عن طريق خلط 1 mg من الصبغة three onap DHQ في 50 µL من الإيثانول.

قم بتوزيع حصص مقدارها 2 µL في أنابيب ملفوفة بورق القصدير، وتُحفظ عند درجة حرارة -20 °C. يتم تحضير محلول الصبغة العامل يوميًا بتخفيف بنسبة 1:200 في A CSF. بعد ذلك، يتم تحضين الشريحة على ورق ترشيح مرطب بـ A CSF وتُصبغ باستخدام 90 µL من الصبغة لمدة 16 دقيقة.

بعد ذلك، اشطفه ثم ضعه في غرفة تسجيل الواجهة. ضع أقطاب التحفيز والتسجيل كما هو موضح في تسجيل الجهد الميداني خارج الخلية.

اضبط شدة التحفيز الضوئي حتى يتمركز الاستجابة في منتصف الكاميرا. عادةً ما يتم الحصول على صور النطاق بمعدل من 500 إلى 1000 إطار في الثانية. قم بتشغيل غالق التحفيز الضوئي قبل 200 milliseconds من التحفيز الكهربائي للسماح باستقرار عملية التبييض الضوئي السريع الأولية.

التوقف لمدة 10 ثوانٍ بين التجارب. يتم التناوب في تجارب الاستحواذ بين التحفيز الكهربائي والتحفيز غير الكهربائي للسماح لاحقاً بطرح خلفية التحفيز غير الكهربائي. ثم يتم تسجيل شدة الضوء في حالة الراحة قبل فتح الغالق.

يمكن تحليل كل تجربة لـ VSD كفيلم من قراءات الفلورة. أي أن كل تجربة عبارة عن مصفوفة بيانات ثلاثية الأبعاد تحتوي على قيم في الأبعاد المكانية X و Y عبر الزمن. قم بتسجيل من 10 إلى 12 تجربة VSD في كل حالة اختبار، واحسب التغير في الفلورة الموحدة قبل الإضاءة داخل البكسل الواحد وفقاً للمخطوطة المرفقة.

يظهر هذا الشكل مثالاً لتسجيل f-e-p-s-p في المنطقة CA one. يمثل الانحراف الأول إلى الأسفل أثر التحفيز (stimulus artifact)، يليه تدفق الألياف قبل التشابكية (presynaptic fiber volley)، ثم f-e-p-s-p. تظهر هنا منحنيات المدخلات والمخرجات التي توضح انخفاضاً في صافي الفعالية التشابكية في CA one بعد إصابة الارتجاج السوائلي (fluid percussion injury).

وفيما يلي منحنيات المدخلات والمخرجات التي توضح زيادة في الفعالية التشابكية الصافية في التلفيف المسنن بعد إصابة FPI. إليكم مثالاً على تيار ما بعد التشابك الاستثاري التلقائي من خلية CA1 parametal موضح هنا. وهذا مثال على سلسلة جهد الفعل من خلية CA1 parametal وعصبون بيني سريع الومض في CA1.

هذه خلية عصبية بينية مثبطة من المنطقة ca one مملوءة بصبغة Lucifer yellow وتخلو من الأشواك الشجيرية، وهنا خلية عصبية هرمية من المنطقة ca one مملوءة بصبغة Lucifer yellow وتحتوي على أشواك شجيرية. توضح هذه الأشكال مقطعاً تاجياً من حصين الفأر. وتمثل البكسلات المتدرجة من الأصفر إلى الأحمر النشاط الاستثاري في المنطقة ca one بعد 14 milliseconds من تحفيز الألياف الواردة في collateral shafer.

يشير اللون الأحمر إلى إزالة استقطاب أكبر، بينما يشير اللون الأصفر إلى إزالة استقطاب أقل ولكنها تظل ذات دلالة. وتمثل البكسلات الزرقاء مواقع النشاط التثبيطي في المنطقة ca 1 بعد 56 milliseconds من تحفيز Shafer collateral الوارد نفسه، بينما يشير اللون الأزرق الداكن إلى فرط استقطاب أكبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الجمع بين تقنيات تسجيل متعددة خارج الجسم (ex vivo) لمعالجة حالة مرضية ذات صلة سريريًا تتضمن خللاً في الدارة.