عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA)

الهدف العام من التجربة التالية هو تحقيق ترانسفكشن (transfection) محدد الموقع في الخلايا الملتصقة. ويتم ذلك عن طريق استزراع طبقة أحادية من الخلايا على مصفوفة أقطاب كهربائية دقيقة. وكخطوة ثانية، يؤدي تطبيق نبضة كهربائية على أقطاب محددة إلى حدوث تثقيب كهربائي (electroporation) للخلايا المستهدفة الملتصقة فوق تلك الأقطاب.

يؤدي هذا إلى تكوين مسام في غشاء الخلية تسمح بدخول الجزيئات الخارجية إلى الخلية. ويمكن بعد ذلك فحص الخلايا المستهدفة للكشف عن النمط الظاهري الناتج باستخدام مقايسة مناسبة. وتتميز تقنية عفن الخلية (transfection) على المقياس الميكروي التي وصفناها هنا بعدة مزايا رئيسية مقارنة بتقنيات عفن الخلية التقليدية، مثل التثقيب الكهربائي الكلي أو عفن الخلية الكيميائي.

أ، تتيح لنا هذه الطريقة تحقيق تحكم مكاني دقيق في عملية عفن الخلايا (transfection) نفسها، وتساعدنا على عفن خلايا مفردة أو مجموعات من الخلايا بكفاءة عالية حتى في الخطوط الخلوية التي يصعب عفنها. ب، إنه نهج قابل للتوسع بسهولة ويساعدنا في تنفيذ مقايسات جزيئية عالية الإنتاجية. وتكمن إحدى المزايا الرئيسية لاستخدام مصفوفة أقطاب مجهرية (micro electrode area) للعفن الموضعي في أنها تتيح التقييم الوظيفي المتزامن للخلايا المستهدفة، مثل الفيزيولوجيا الكهربائية الكمية والتغيرات المورفولوجية.

لبدء الإجراء، قم بتعقيم مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) في جهاز التعقيم (autoclave)، ثم انقل الـ MEA المعقمة إلى غطاء التدفق الصفائحي (laminar flow hood)، وضعها في طبق بتري بولي ستيرين معقم قياسي. قبل استزراع الخلايا على الـ MEA، قم بتعقيم غطاء التدفق الصفائحي عن طريق تشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 20 دقيقة. إذا كانت الـ MEA حساسة للأشعة فوق البنفسجية، قم بتغطية طبق بتري الذي يحتوي على الـ MEA بورق ألومنيوم معقم أثناء تعرض غطاء التدفق للأشعة فوق البنفسجية. بعد ذلك، قم بمعالجة سطح الـ MEA بـ 10 µg/mL من الفبرونكتين (fibronectin) لمدة ساعة إلى ساعتين بالنسبة لخلايا helo.

قم بإجراء عملية غسل باستخدام الماء منزوع الأيونات (DI water) واترك مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) لتجف في الهواء داخل غطاء التدفق الصفائحي. بعد ذلك، قم بحصاد الخلايا من خط خلوي مستمر من الخلايا الثديية الملتصقة باستخدام تريبسين إيتا (trypsin ETTA)، وارفع تركيزها ليصل إلى 100 إلى 200 خلية لكل µL في 1 mL من الوسط الخلوي من أجل الزراعة. ثم ضع قطرة بحجم 20 إلى 30 µL من الوسط المحتوي على الخلايا فوق الـ MEA.

تأكد من أن حجمها كبير بما يكفي لتغطية جميع الأقطاب الكهربائية الموجودة على مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA). بعد ذلك، انقل طبق بيتري الذي يحتوي على MEA إلى حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة تتراوح بين ساعتين إلى أربع ساعات.

بعد استزراع الخلايا، انقل طبق بيتري الذي يحتوي على مصفوفة الخلايا الكهربائية (MEA) من الحاضنة إلى غطاء التدفق الصفائحي. بعد ذلك، أضف برفق من 400 إلى 500 µL من الوسط الغذائي المسخن مسبقاً إلى 37 °C في بئر مصفوفة الخلايا الكهربائية، ثم افحص تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا لا تزال ملتصقة وموزعة بالتساوي على سطح مصفوفة الخلايا الكهربائية. بعد ذلك، انقل مصفوفة الخلايا الكهربائية مرة أخرى إلى الحاضنة، وبعد مرور 8 إلى 12 ساعة من استزراع الخلايا، قم بإجراء عملية غسل واحدة أو اثنتين باستخدام PBS لإزالة أي خلايا ميتة.

في التجربة النموذجية، تكون الخلايا عادةً جاهزة لعملية عفن transfection بعد 24 إلى 48 ساعة من التثبيت. وللحفاظ على اتساق كفاءة التثقيب الكهربائي (electroporation)، يُوصى بالانتظار حتى تقترب المزرعة من حالة التلاقي (confluency) قبل إجراء التثقيب الكهربائي. ومن أجل تحقيق عملية transfection عالية الكفاءة لـ sarna، من الضروري أولاً تحديد معلمات نبضة جهد التثقيب الكهربائي المثلى لمصفوفة أقطاب كهربائية دقيقة (MEA) معينة.

نصف هنا تسلسلاً من الخطوات التجريبية التي تتضمن استخدام يوديد البروبيديوم (propidium iodide) لتحديد معايير التثقيب الكهربائي المثلى قبل إجراء عملية التثقيب الكهربائي. قم بتحضير محلول يتراوح حجمه بين 300 إلى 500 µL بتركيز 30 µg/mL من PI في منظم تثقيب كهربائي مبرد في الثلج، و 400 µL من محلول كالسيوم AM بتركيز 4 µM في PBS. بعد ذلك، انقل مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) من الحاضنة إلى غطاء التدفق الصفائحي.

أزل الوسط الخلوي من مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) وقم بغسلها باستخدام PBS. بعد ذلك، أضف من 300 إلى 500 µL من منظم التثقيب الكهربائي المبرد بالثلج مع pi. ثم ضع فاصلًا بارتفاع 1 ملم في مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA).

من المهم للغاية التأكد من عدم ملامسة الخلايا الموجودة في مركز مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA). بعد ذلك، قم بتوصيل الـ MEA بالوصلة الكهربائية البينية واختيار الأقطاب الكهربائية المطلوبة لعملية التثقيب الكهربائي. تلي ذلك مرحلة تطبيق النبضات الكهربائية بسعة ومدة النبضة المطلوبتين على الأقطاب الكهربائية المستهدفة لإتمام خطوة التثقيب الكهربائي.

اخفض الكاثود الفولاذي المغطى بورق الألمنيوم في بئر الـ MEA حتى يلامس الفاصل الذي يبلغ سمكه 1 mm. مباشرة بعد ذلك، قم بتطبيق نبضات كهربائية على الأقطاب الكهربائية المستهدفة. بعد ذلك، كرر الخطوة مع مجموعة مختلفة من الأقطاب الكهربائية اعتماداً على التصميم التجريبي.

في تجاربنا على خلايا helo، لاحظنا أن نبضة جهد واحدة بسعة تتراوح من 3 فولت إلى 9 فولت ومدة تتراوح من 1 مللي ثانية إلى 10 مللي ثانية، وباستخدام قطب كهربائي بحجم 100 ميكرومتر، أدت إلى عملية ثقب كهربائي ناجحة مع حد أدنى من موت الخلايا. فور تطبيق نبضات الجهد، يتم نقل مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) إلى الحاضنة لمدة خمس دقائق.

بعد فترة تحضين تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، قم بإزالة الفاصل بلطف من مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA). بعد ذلك، قم بإزالة 75% من محلول التثقيب الكهربائي من بئر الـ MEA واستبدله بوسط خلوي دافئ. ثم انقل الـ MEA مرة أخرى إلى الحاضنة.

بعد فترة حضانة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات، استبدل الوسط الخلوي في بئر الـ MEA بـ 300 إلى 500 µL من محلول calcium AM بتركيز 4 µM في PBS. أعد الـ MEA إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة أخرى بعد حضانة الخلايا مع calcium AM. استبدل calcium AM في البئر بـ PBS بعد خطوة غسيل، ثم التقط الصور الفلورية للخلايا باستخدام مجهر ضوئي مزود بمرشحات لـ pi.

يؤدي امتصاص PI نتيجة للتثقيب الكهربائي إلى جعل الخلايا تومض باللون الأحمر، بينما يجعل calcium am الخلايا الحية تومض باللون الأخضر. يمكن تقدير حيوية الخلايا لكل قطب كهربائي باستخدام هذه المعادلة، كما يمكن تقدير كفاءة التثقيب الكهربائي لكل قطب كهربائي باستخدام هذه المعادلة. وبمجرد تحديد معاملات التثقيب الكهربائي المثلى، يمكن استخدامها لإيصال جزيء a إلى موقع محدد، علماً بأن إجراء التثقيب الكهربائي لجزيئات siRNA هو نفسه إجراء التثقيب الكهربائي لـ pi.

يظهر هنا التوصيل الموجه لموقع محدد من يوديد البروبيديوم في خلايا helo على قطب كهربائي بقياس 200 ميكرومتر. تم إجراء مقايسة الخلايا الحية القائمة على الكالسيوم بعد ساعتين من عملية التثقيب الكهربائي. تشير الفلورة الخضراء هنا إلى الخلايا الحية، بينما توضح الفلورة الحمراء هنا امتصاص pi بواسطة الخلايا الموجودة على القطب الكهربائي.

إليك الصورة المتراكبة. هذه الخلايا تعرضت للتثقيب الكهربائي وهي حية، بينما هذه الخلايا ميتة. يوضح هذا الشكل عملية ترصيف irna موسوم في خلايا rumine باستخدام قطب كهربائي بقطر 200 micrometer، ويوضح هذا الشكل عملية ترصيف خلايا hela باستخدام irna موسوم بـ Alexa 4 88 باستخدام قطب كهربائي بقطر 100 micrometer.

تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا التي تم نقل irna إليها، بينما تشير الأسهم السوداء إلى الخلايا الميتة. يمكن توسيع التقنية التي استعرضناها هنا لتشمل خطوط خلوية مختلفة، بما في ذلك خطوط الخلايا الأولية التي يصعب نقل المادة الوراثية إليها، ولنقل جزيئات أكبر إليها مثل البلازميدات والبروتينات.