Name: عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA) (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: تعلم طريقة التحويل الموقعي عالي الكفاءة للخلايا اللاصقة باستخدام صفائف المسرى المكروي. تُحسّن هذه التقنية إدخال الحمض النووي الصغير المُتدخل وتُمكّن من فحص التغيرات الظاهرية بدقة عالية في الخلايا المستهدفة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. MEA إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إما للاستخدام في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التجارب الصعق الكهربائي و تكون ملفقة باستخدام معيار تقنية ضوئيه كما هو موضح سابقا 18 أو شراؤها مباشرة من البائعين من الشركات المصنعة مثل أنظمة MEA قناة موضوع <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> وألفا MED العلمية المحدودة، <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . ملفقة والاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة في التجارب لدينا في المنزل في منشأة غرفة نظيفة في جامعة ولاية أريزونا، والتي تدار من قبل مركز بحوث الإلكترونيات الحالة الصلبة (CSSER). كان الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة في تجاربنا أقطاب أكسيد الإنديوم 32 القصدير في قدرها 8 بنسبة 4 مجموعة مع أحجام الإطارات 50-200 ميكرون الكهربائي داخل الزجاج 1 سم القطر الداخلي أيضا. الزجاج والمستعبدين جيدا على استخدام polydimethylsiloxane MEA (PDMS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم MEA في الأوتوكلاف قبل خلية قeeding. وسائل أخرى للتعقيم مثل تمرغ في الايثانول 70٪، ويمكن أيضا علاج الأشعة فوق البنفسجية ومعالجة المياه الساخنة كما هو موضح في أماكن أخرى يمكن استخدامها طالما أنها لا تعرض للخطر سلامة MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل MEA تعقيمها إلى الصفحي هود تدفق ووضعه في معيار البوليسترين طبق بتري معقمة. قبل البذر الخلايا على وMEA، تعقيم تدفق الصفحي هود تحول على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة. إذا كان MEA حساسة للضوء الأشعة فوق البنفسجية تغطية طبق بتري تحتوي على رقائق الألومنيوم مع MEA عقيمة في حين أن التدفق تحت غطاء محرك السيارة الإضاءة فوق البنفسجية. </li></ol> 2. بذر خلايا في الشرق الأوسط وأفريقيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحصاد من خط الخلية تشغيل خلايا الثدييات تمسكا باستخدام التربسين / EDTA ورفعها إلى تركيز من 100-200 خلية / ميكرولتر في 1 مل سائل الإعلام خلية للطلاء. في تجاربنا نجحنا في زراعة NIH 3T3 خط الخلية الليفية، هيلا خط الخلية الأولية والخلايا العصبية القشرية وقرن آمون في MEA. </li><li&gt; ضع قطرة 20-30 ميكرولتر من وسائل الاعلام مع الخلايا على وMEA. نقل طبق بتري مع MEA إلى الحاضنة. من المهم للتأكد من أن حجم الانخفاض خلية كبيرة بما يكفي لتغطية جميع الأقطاب على MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ساعة بعد البذر ونقل الخلايا طبق بتري مع MEA من الحاضنة إلى غطاء محرك السيارة وتدفق الصفحي إضافة بلطف ميكرولتر من قبل وسائل الإعلام 400-500 درجة حرارة (37 ° C) إلى MEA جيدا. تحقق تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا لا تزال تعلق وتنتشر بالتساوي على سطح MEA. نقل مرة أخرى إلى MEA الحاضنة. الانتظار ساعة 2 قبل فترة إضافة وسائل الإعلام تضمن ما يكفي من الوقت للخلايا الالتزام مع سطح MEA. يمكن إضافة وسائل الإعلام خلية قريبا جدا بعد البذر الخلايا يغسل الخلايا. إذا الخلايا لا يلتزمون بشكل جيد على MEA، يمكن علاج سطحه مع عوامل مثل مرفق الخلية aspolylysine، فبرونيكتين، وlaminin لتحسين التصاق الخلية. في تجاربنا الخلية هيلا تعاملنا مع السطح عادة MEA مع fibronectiن (10 ميكروغرام / مل) لمدة 1-2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8-12 ساعة بعد البذر الخلايا، نفذ 1-2 يغسل مع PBS لإزالة أي خلايا ميتة. يمكن استبدال كل خلية متوسطة 24-48 ساعة حسب الحاجة. في تجربة نموذجية، وعادة ما تكون الخلايا جاهزة للساعة 24-48 ترنسفكأيشن بعد البذر. للحفاظ على التناسق في كفاءة الصعق الكهربائي فمن المستحسن الانتظار حتى الثقافة لا يقل عن 80٪ متموجة قبل الصعق الكهربائي. </li></ol> 3. مواقع محددة ترنسفكأيشن من سيرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول حمض النووي. لترنسفكأيشن سيرنا، إعداد سيرنا 1-2 ميكرومتر في حل الصعق الكهربائي العازلة الجليد الباردة الصعق الكهربائي للوصول الى الحجم النهائي من 200-400 ميكرولتر. في هذه المقالة نحن لشرح الفيديو ترنسفكأيشن من خلايا هيلا مع 488 اليكسا تسلسل مخلوط مترافق من سيرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل MEA مع الخلايا من الحاضنة إلى الصفحي هود العقيمة التدفق. إزالة وسائل الإعلام خلية من MEA وإجراء غسيل مع PBS. بعد ذلك، أضف 200-400 ميكرولتر من أنام الباردة سيرنا ميكرومتر 1 حل الصعق الكهربائي إلى البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق نبضات كهربائية انوديك مربع لالأقطاب المستهدفة (راجع الخطوة 4 لتحديد أفضل المعايير للنبض الكهربائية). في تجاربنا استخدمنا الأدوات الواقعية 2414A مولد الموجي لتوليد النبضات الكهربائية والمزدوجة المضمنة-حزمة (DIP) 16 دبوس مشبك لاجراء اتصالات مع منصات السندات MEA. يمكن توصيل المولد الموجي لمقطع DIP عن طريق لوحة الدوائر المطبوعة لتقديم demultiplexor الانتقائية من الأقطاب الكهربائية على حدة. لالإلكترود المرجعي، ضع الكاثود الصلب في وسائل الإعلام الخلية. وفي الوقت نفسه تخفيض الإلكترود المرجعي الصلب في وسائل الإعلام من المهم للغاية للتأكد من أنه لا يجعل الاتصال مع سطح MEA. عند الاتصال، فإنه يمكن أن يسبب الضرر للخلايا وMEA و. فمن المستحسن لخفض القطب إشارة إلى موقف من 1 مم فوق الخلايا. يمكن وضعها A التبادل مع ارتفاع 1 مم في البئر للمساعدة في وضع المرجعerence القطب. نهج بديل لاستخدام القطب الكهربائي مرجع خارجي هو استخدام الأقطاب الكهربائية المجاورة والأنود الكاثود أزواج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد تطبيق نبضات كهربائية إلى الأقطاب الكهربائية على استهداف MEA، نقل مرة أخرى إلى MEA الحاضنة. بعد فترة حضانة المرض من 5 دقائق، استبدل بلطف 75٪ من المخزن المؤقت مع الصعق الكهربائي قبل تحسنت (37 ° C) وسائل الاعلام الخلية. في وقت لاحق، ويمكن القيام الفلورسنت التصوير للتأكد من تسليم سيرنا الموسومة fluorescently إلى الخلايا. </li></ol> 4. الصعق الكهربائي معلمة الأمثل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد الأمثل المعلمات نبض الكهربائية ل، الصعق الكهربائي و الصعق الكهربائي و التجارب التصميم لمجموعة من القيم من السعة النبض، النبض مدة، وعدد النبضات. في تجربتنا مع خلايا هيلا، لاحظنا أن الجهد نبض واحد من السعة في الفترة من 3 إلى 9 V V، ومدة من 1 إلى 10 ميللي ثانية ميللي ثانية لحجم الإلكترود من 100 ميكرومتر أدى إلى الصعق الكهربائي و ناجحة مع ميلنيمال زنزانة الموت. فمن توصيتنا أن تكون متنوعة معلمة واحدة في وقت واحد والبعض الآخر يتم الاحتفاظ المستمر. لquantitate كفاءة الصعق الكهربائي لكل من المعلمات نبض، ونحن نستخدم يوديد propidium (PI)، صبغة impermeant الخلية التي بقع المواد النووية، ومقرها حي منهجية الفحص، كما هو موضح في الخطوات 4،2-4،5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأسيس ثقافة الخلية على MEA اتباع الإرشادات الموضحة في الخطوات 1 و 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الصعق الكهربائي و إعداد ميكرولتر من 30 ميكروغرام 300-500 / مل حل PI في المخزن المؤقت الجليد الباردة الصعق الكهربائي و 400 ميكرولتر من 4 ميكرومتر calcien AM الحل في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل MEA من الحاضنة إلى الصفحي هود التدفق. إزالة وسائل الإعلام خلية من MEA وإجراء غسيل مع PBS. بعد ذلك، أضف 300-500 ميكرولتر من العازلة الصعق الكهربائي الجليد الباردة مع PI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق نبضات كهربائية مع السعة ومدة النبض المطلوب لالأقطاب المستهدفة (والمعدات المستخدمة في تجاربنا لتوليد الكهرباء وتطبيقيوصف نبض tric إلى MEA في الخطوة 3.3). لالإلكترود المرجعي خفض إما القطب الصلب في المخزن المؤقت الصعق الكهربائي في MEA جيدا أو استخدام القطب الكهربائي المجاور كمرجع. يمكن من خلال تطبيق انتقائي نبضات من سعة متفاوتة أو فترات مختلفة لأقطاب إجراء تجارب متعددة على نفس الجهاز. على سبيل المثال، على 32 MEA القطب، يمكن إجراء التجارب عن طريق تقسيم 8 الأقطاب 32 في 8 مجموعات، تتكون كل منها من 4 الأقطاب الكهربائية. ويمكن بعد كل مجموعة من المجموعات 8 ينبغي أن يحفزه نبضة الجهد مستطيل واحد لمدة 5 ميللي ثانية مع سعة متفاوتة في 3 V-6 مجموعة V V بزيادات 0.5 و مجموعة واحدة يمكن استخدامها كمجموعة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد تطبيق نبضات الجهد لنقل MEA الحاضنة لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة بلطف 75٪ من المخزن المؤقت الصعق الكهربائي من MEA جيدا واستبدالها مع وسائل الاعلام الخلية الدافئ. نقل مرة أخرى إلى MEA الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة من 2-4 ساعةاستبدال وسائل الإعلام خلية في MEA جيدا مع 300-500 ميكرولتر من 4 ميكرومتر AM Calcein الحل في برنامج تلفزيوني. نقل مرة أخرى إلى MEA حاضنة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة الخلايا مع Calcein AM، يستعاض عن Calcein AM الحل في الشرق الأوسط وأفريقيا بشكل جيد مع PBS يغسل بعد سنتين مع PBS. الحصول على الصور من الفلورسنت الخلايا باستخدام المجهر الضوئي مع المرشحات للمع PI (الإثارة / الانبعاث - 535 نانومتر nm/617) وCalcein AM (الإثارة / الانبعاث - 490 نانومتر nm/520). امتصاص PI، وذلك بسبب الصعق الكهربائي، ليتألق يسبب الخلايا الحمراء ويسبب AM Calcein الخلايا التي هي على قيد الحياة ليتألق الخضراء. ثلاثة سيناريوهات المحتملة التي يمكن ملاحظتها هي 1) خلية electroporated وعلى قيد الحياة (وسوف يتألق كل من الأحمر والأخضر)، 2) الخلايا على قيد الحياة ولكن ليس electroporated (سوف يتألق الخضراء فقط) و 3) والخلايا الميتة بسبب الصعق الكهربائي (يتألق الأحمر فقط) . تم حساب بقاء الخلية كنسبة مئوية من إجمالي عدد الخلايا على قيد الحياة على القطب وممثل المؤسسة الصعق الكهربائيتم حساب iciency كنسبة مئوية من إجمالي عدد خلايا محملة PI / سيرنا. </li></ol> 5. ممثل النتائج ويظهر الشكل 1 تحميل مواقع محددة من الخلايا الحله مع PI. ويمكن ملاحظة أن الخلايا فقط على القطب إثبات وجود امتصاص PI (الشكل 1B). أجريت مقايسة الحية واستخدمت الصعق الكهربائي و آخر لتقييم الجدوى من الخلايا (الشكل 1A). كفاءة الصعق الكهربائي وبقاء الخلية للمثال هو مبين في الشكل 1 هي 81.8٪ و٪ 96.1 على التوالي. ويمكن تحقيق عالية الكفاءة وبقاء الخلية الصعق الكهربائي عن طريق تحسين المعلمات نبض الصعق الكهربائي. ويرد في مواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا الحله مع سيرنا الموسومة fluorescently لنبض الصعق الكهربائي الأمثل (8 V، 1 ميللي ثانية) في الشكل 2. تم العثور على كفاءة الصعق الكهربائي لسيرنا في 8 مللي ثانية V 1، ليكون 74،4٪ 16.0 ± وتم العثور على بقاء الخلية لتكون 87.9 ± 8.4٪ (كل البيانات ممثلا يعني ± الانحراف المعياري، N = 5). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> الشكل 1. بمواقع محددة تسليم PI في خلايا هيلا على القطب ميكرومتر 200 (6 V، 5 ميللي ثانية). A) إجراء فحص Calcien الحية (2) تستند الصعق الكهربائي و آخر ساعة. يشار إلى الخلايا على قيد الحياة من قبل مضان أخضر. B) الأحمر مضان يدل على امتصاص من قبل خلايا PI على القطب. C) صورة فرضه من A B. والأسهم البيضاء تشير إلى الخلايا التي هي وelectroporated على قيد الحياة. الأسهم السوداء تشير إلى الخلايا التي قد لقوا حتفهم. دائرة الابيض في B، C ويشير مخطط القطب. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> الشكل 2. ترنسفكأيشن من خلايا هيلا مع الموسومة fluorescently scrambl(ه) من تسلسل سيرنا. A) صورة خلايا هيلا على القطب ميكرومتر 100 transfected مع سيرنا 488 اليكسا الموسومة (8 V، 1 ميللي ثانية). B) صورة نوى الخلايا ملطخة دابي. الدائرة البيضاء يصادف حافة القطب.

<ol><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).</li>
<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550(2002).</li>
<li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).</li>
<li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).</li>
<li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ%2C+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).</li>
<li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+%28ethyleneimine%29+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium%3F+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+%28MEA%29+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2C+IEEE+Transactions+on%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li>
<li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li>
<li>Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).</li>
<li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594(2005).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li>
<li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذه المقالة نحن الفيديو شرح استخدام MEA لمواقع محددة من خلايا هيلا ترنسفكأيشن مع سيرنا مخلوط تسلسل. واحدة من مزايا هذه التكنولوجيا هو انطباقها على خطوط مختلفة من الخلايا بما في ذلك خطوط الخلايا الأولية. وقد أظهرت مختبرنا سابقا استخدام هذه التكنولوجيا لمواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية قرن آمون الثقافة الأولية من الفئران اليوم E18 القديمة وNIH-3T3 الخلايا مع تسلسل سيرنا مخلوط وGFP البلازميد 18 و 19. لقد كان لدينا أيضا النجاح في تقديم سيرنا ضد هدف وظيفي في خلاي...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> خلية الإعلام: المتقدمة MEM الجلوتامين L-200 ملي مول البنسلين / الستربتوميسين المصل البقري الجنين </td><td> Gibco / إينفيتروجن Himedia المختبرات / VWR Lonza المجموعة المحدودة Gibco / إينفيتروجن </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> خلية الإعلام التركيب: 2٪ FBS، Pennstrep 2٪ الجلوتامين L-و 2٪ في المقدمة MEM </td></tr><tr><td> التربسين EDTA </td><td> Mediatech، وشركة </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech، وشركة </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> سارعت الكسا 488 و رودامين الموسومة sequسينعقد سيرنا </td><td> QIAGEN، وشركة </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> الصعق الكهربائي العازلة </td><td> Biorad المختبرات </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> مولد الموجي </td><td> واقعي </td><td> 2414A </td><td> ويمكن استخدام أي الموجي / مولد النبض التي يمكن أن توفر النبضات المطلوب. </td></tr></table>

عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (mea)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

حققت اكتشاف المسار رني في حقيقيات النوى والتطور اللاحق للعملاء رني، مثل سيرنا وshRNA، وهي طريقة فعالة جدا لإسكات جينات معينة 1-8 لعلم الجينوم الوظيفي والعلاج. ومن التحديات الرئيسية المشاركة في الدراسات القائمة على رني هو تسليم من وكلاء رني إلى الخلايا المستهدفة. التقنيات التقليدية التسليم غير الفيروسية، مثل الصعق الكهربائي ومعظم أساليب ترنسفكأيشن الكيميائية غالبا ما تفتقر إلى المراقبة الضرورية المكانية على التسليم وتحمل الكفاءة ترنسفكأيشن الفقراء 9-12. وقد أدت التطورات الحديثة في طرائق نقل المواد الكيميائية مثل الدهون الموجبة، والبوليمرات الموجبة والجسيمات النانوية في تعزيز الكفاءة ترنسفكأيشن غاية 13. ومع ذلك، هذه التقنيات لا تزال دون توفر السيطرة المكانية دقيقة على التسليم التي يمكن أن المنمنمة الفئات استفادة هائلة التكنولوجيات الفائقة الإنتاجية والدراسات خلية واحدة من خلايا والتحقيق خلايا التفاعلات. NT &quot;مكنت&gt; التطورات التكنولوجية الحديثة في إيصال الجينات عالية الإنتاجية ترنسفكأيشن من الخلايا الملتصقة 14-23، أغلبية التي تستخدم الصعق الكهربائي الميكروسكيل. الصعق الكهربائي و يقدم الميكروسكيل دقيقة المكانية والزمانية السيطرة على تسليم (إلى الخلايا واحدة) وتبين أنه لتحقيق الكفاءة العالية 19، 24-26. بالإضافة إلى ذلك، النهج القائم الصعق الكهربائي و لا تحتاج إلى فترة طويلة من الحضانة (عادة 4 ساعات) مع المجمعات سيرنا وDNA عند الضرورة في الطرق الكيميائية ومقرها ترنسفكأيشن يؤدي إلى الدخول المباشر من سيرنا عارية وDNA لا يمكن أن يتحقق في جزيئات الخلية السيتوبلازم. ونتيجة لذلك التعبير الجيني في وقت مبكر من ست ساعات بعد ترنسفكأيشن 27. مختبرنا أظهرت في السابق استخدام صفائف مسرى مكروي (MEA) لمواقع محددة في ترنسفكأيشن تمسكا الثقافات خلايا الثدييات 17-19. في النهج القائم MEA، ويتحقق تسليم حمولة الوراثية عبر electroporati الصغيرة النطاق المترجمةعلى من الخلايا. تطبيق من نبض الكهربائية لأقطاب مختارة يولد المجال الكهربائي المحلي الذي يؤدي إلى الصعق الكهربائي من الخلايا الموجودة في المنطقة من الأقطاب الإلكترونية المبرمجة. مراقبة مستقلة من الأقطاب الكهربائية الدقيقة يوفر السيطرة المكانية والزمانية على ترنسفكأيشن وتمكن أيضا تجارب متعددة ترنسفكأيشن القائمة التي سيتم تنفيذها على نفس الثقافة زيادة الإنتاجية والحد من ثقافة التجريبية إلى ثقافة التنوع. نحن هنا وصف الإعداد التجريبية وبروتوكول لترنسفكأيشن من استهداف خلايا هيلا ملتصقة مع سيرنا الموسومة fluorescently تسلسل باستخدام الصعق الكهربائي و مخلوط. ويمكن أيضا نفس البروتوكول استخدامها لترنسفكأيشن من ناقلات البلازميد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للبروتوكول الموصوفة هنا مدد بسهولة إلى مجموعة متنوعة من خطوط خلايا الثدييات مع تعديلات طفيفة. توافر التجارية الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع كل من القطب أنماط محددة مسبقا والعرف جعل هذا الأسلوب للوصول رس مختبرات معظم البحوث الأساسية مع خلية المعدات الثقافة.

تفاصيل المقال بروتوكول لمواقع محددة ترنسفكأيشن من مخلوط تسلسل سيرنا في ثقافة خلايا الثدييات تمسكا باستخدام مجموعة ومسرى مكروي (MEA).

عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA)

لقد حقق اكتشاف مسار تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) في حقيقيات النواة، وما تلاه من تطوير لعوامل تداخل الحمض النووي الريبي، مثل الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) والحمض النووي الريبي قصير الشعر (shRNA)، طريقة فعالة لـ ...

الهدف العام من التجربة التالية هو تحقيق ترانسفكشن (transfection) محدد الموقع في الخلايا الملتصقة. ويتم ذلك عن طريق استزراع طبقة أحادية من الخلايا على مصفوفة أقطاب كهربائية دقيقة. وكخطوة ثانية، يؤدي تطبيق نبضة كهربائية على أقطاب محددة إلى حدوث تثقيب كهربائي (electroporation) للخلايا المستهدفة الملتصقة فوق تلك الأقطاب.يؤدي هذا إلى تكوين مسام في غشاء الخلية تسمح بدخول الجزيئات الخارجية إلى الخلية. ويمكن بعد ذلك فحص الخلايا المستهدفة للكشف عن النمط الظاهري الناتج باستخدام مقايسة مناسبة. وتتميز تقنية عفن الخلية (transfection) على المقياس الميكروي التي وصفناها هنا بعدة مزايا رئيسية مقارنة بتقنيات عفن الخلية التقليدية، مثل التثقيب الكهربائي الكلي أو عفن الخلية الكيميائي.أ، تتيح لنا هذه الطريقة تحقيق تحكم مكاني دقيق في عملية عفن الخلايا (transfection) نفسها، وتساعدنا على عفن خلايا مفردة أو مجموعات من الخلايا بكفاءة عالية حتى في الخطوط الخلوية التي يصعب عفنها. ب، إنه نهج قابل للتوسع بسهولة ويساعدنا في تنفيذ مقايسات جزيئية عالية الإنتاجية. وتكمن إحدى المزايا الرئيسية لاستخدام مصفوفة أقطاب مجهرية (micro electrode area) للعفن الموضعي في أنها تتيح التقييم الوظيفي المتزامن للخلايا المستهدفة، مثل الفيزيولوجيا الكهربائية الكمية والتغيرات المورفولوجية.لبدء الإجراء، قم بتعقيم مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) في جهاز التعقيم (autoclave)، ثم انقل الـ MEA المعقمة إلى غطاء التدفق الصفائحي (laminar flow hood)، وضعها في طبق بتري بولي ستيرين معقم قياسي. قبل استزراع الخلايا على الـ MEA، قم بتعقيم غطاء التدفق الصفائحي عن طريق تشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 20 دقيقة. إذا كانت الـ MEA حساسة للأشعة فوق البنفسجية، قم بتغطية طبق بتري الذي يحتوي على الـ MEA بورق ألومنيوم معقم أثناء تعرض غطاء التدفق للأشعة فوق البنفسجية. بعد ذلك، قم بمعالجة سطح الـ MEA بـ 10 µg/mL من الفبرونكتين (fibronectin) لمدة ساعة إلى ساعتين بالنسبة لخلايا helo.قم بإجراء عملية غسل باستخدام الماء منزوع الأيونات (DI water) واترك مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) لتجف في الهواء داخل غطاء التدفق الصفائحي. بعد ذلك، قم بحصاد الخلايا من خط خلوي مستمر من الخلايا الثديية الملتصقة باستخدام تريبسين إيتا (trypsin ETTA)، وارفع تركيزها ليصل إلى 100 إلى 200 خلية لكل µL في 1 mL من الوسط الخلوي من أجل الزراعة. ثم ضع قطرة بحجم 20 إلى 30 µL من الوسط المحتوي على الخلايا فوق الـ MEA.تأكد من أن حجمها كبير بما يكفي لتغطية جميع الأقطاب الكهربائية الموجودة على مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA). بعد ذلك، انقل طبق بيتري الذي يحتوي على MEA إلى حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة تتراوح بين ساعتين إلى أربع ساعات.بعد استزراع الخلايا، انقل طبق بيتري الذي يحتوي على مصفوفة الخلايا الكهربائية (MEA) من الحاضنة إلى غطاء التدفق الصفائحي. بعد ذلك، أضف برفق من 400 إلى 500 µL من الوسط الغذائي المسخن مسبقاً إلى 37 °C في بئر مصفوفة الخلايا الكهربائية، ثم افحص تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا لا تزال ملتصقة وموزعة بالتساوي على سطح مصفوفة الخلايا الكهربائية. بعد ذلك، انقل مصفوفة الخلايا الكهربائية مرة أخرى إلى الحاضنة، وبعد مرور 8 إلى 12 ساعة من استزراع الخلايا، قم بإجراء عملية غسل واحدة أو اثنتين باستخدام PBS لإزالة أي خلايا ميتة.في التجربة النموذجية، تكون الخلايا عادةً جاهزة لعملية عفن transfection بعد 24 إلى 48 ساعة من التثبيت. وللحفاظ على اتساق كفاءة التثقيب الكهربائي (electroporation)، يُوصى بالانتظار حتى تقترب المزرعة من حالة التلاقي (confluency) قبل إجراء التثقيب الكهربائي. ومن أجل تحقيق عملية transfection عالية الكفاءة لـ sarna، من الضروري أولاً تحديد معلمات نبضة جهد التثقيب الكهربائي المثلى لمصفوفة أقطاب كهربائية دقيقة (MEA) معينة.نصف هنا تسلسلاً من الخطوات التجريبية التي تتضمن استخدام يوديد البروبيديوم (propidium iodide) لتحديد معايير التثقيب الكهربائي المثلى قبل إجراء عملية التثقيب الكهربائي. قم بتحضير محلول يتراوح حجمه بين 300 إلى 500 µL بتركيز 30 µg/mL من PI في منظم تثقيب كهربائي مبرد في الثلج، و 400 µL من محلول كالسيوم AM بتركيز 4 µM في PBS. بعد ذلك، انقل مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) من الحاضنة إلى غطاء التدفق الصفائحي.أزل الوسط الخلوي من مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) وقم بغسلها باستخدام PBS. بعد ذلك، أضف من 300 إلى 500 µL من منظم التثقيب الكهربائي المبرد بالثلج مع pi. ثم ضع فاصلًا بارتفاع 1 ملم في مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA).من المهم للغاية التأكد من عدم ملامسة الخلايا الموجودة في مركز مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA). بعد ذلك، قم بتوصيل الـ MEA بالوصلة الكهربائية البينية واختيار الأقطاب الكهربائية المطلوبة لعملية التثقيب الكهربائي. تلي ذلك مرحلة تطبيق النبضات الكهربائية بسعة ومدة النبضة المطلوبتين على الأقطاب الكهربائية المستهدفة لإتمام خطوة التثقيب الكهربائي.اخفض الكاثود الفولاذي المغطى بورق الألمنيوم في بئر الـ MEA حتى يلامس الفاصل الذي يبلغ سمكه 1 mm. مباشرة بعد ذلك، قم بتطبيق نبضات كهربائية على الأقطاب الكهربائية المستهدفة. بعد ذلك، كرر الخطوة مع مجموعة مختلفة من الأقطاب الكهربائية اعتماداً على التصميم التجريبي.في تجاربنا على خلايا helo، لاحظنا أن نبضة جهد واحدة بسعة تتراوح من 3 فولت إلى 9 فولت ومدة تتراوح من 1 مللي ثانية إلى 10 مللي ثانية، وباستخدام قطب كهربائي بحجم 100 ميكرومتر، أدت إلى عملية ثقب كهربائي ناجحة مع حد أدنى من موت الخلايا. فور تطبيق نبضات الجهد، يتم نقل مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) إلى الحاضنة لمدة خمس دقائق.بعد فترة تحضين تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، قم بإزالة الفاصل بلطف من مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA). بعد ذلك، قم بإزالة 75% من محلول التثقيب الكهربائي من بئر الـ MEA واستبدله بوسط خلوي دافئ. ثم انقل الـ MEA مرة أخرى إلى الحاضنة.بعد فترة حضانة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات، استبدل الوسط الخلوي في بئر الـ MEA بـ 300 إلى 500 µL من محلول calcium AM بتركيز 4 µM في PBS. أعد الـ MEA إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة أخرى بعد حضانة الخلايا مع calcium AM. استبدل calcium AM في البئر بـ PBS بعد خطوة غسيل، ثم التقط الصور الفلورية للخلايا باستخدام مجهر ضوئي مزود بمرشحات لـ pi.يؤدي امتصاص PI نتيجة للتثقيب الكهربائي إلى جعل الخلايا تومض باللون الأحمر، بينما يجعل calcium am الخلايا الحية تومض باللون الأخضر. يمكن تقدير حيوية الخلايا لكل قطب كهربائي باستخدام هذه المعادلة، كما يمكن تقدير كفاءة التثقيب الكهربائي لكل قطب كهربائي باستخدام هذه المعادلة. وبمجرد تحديد معاملات التثقيب الكهربائي المثلى، يمكن استخدامها لإيصال جزيء a إلى موقع محدد، علماً بأن إجراء التثقيب الكهربائي لجزيئات siRNA هو نفسه إجراء التثقيب الكهربائي لـ pi.يظهر هنا التوصيل الموجه لموقع محدد من يوديد البروبيديوم في خلايا helo على قطب كهربائي بقياس 200 ميكرومتر. تم إجراء مقايسة الخلايا الحية القائمة على الكالسيوم بعد ساعتين من عملية التثقيب الكهربائي. تشير الفلورة الخضراء هنا إلى الخلايا الحية، بينما توضح الفلورة الحمراء هنا امتصاص pi بواسطة الخلايا الموجودة على القطب الكهربائي.إليك الصورة المتراكبة. هذه الخلايا تعرضت للتثقيب الكهربائي وهي حية، بينما هذه الخلايا ميتة. يوضح هذا الشكل عملية ترصيف irna موسوم في خلايا rumine باستخدام قطب كهربائي بقطر 200 micrometer، ويوضح هذا الشكل عملية ترصيف خلايا hela باستخدام irna موسوم بـ Alexa 4 88 باستخدام قطب كهربائي بقطر 100 micrometer.تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا التي تم نقل irna إليها، بينما تشير الأسهم السوداء إلى الخلايا الميتة. يمكن توسيع التقنية التي استعرضناها هنا لتشمل خطوط خلوية مختلفة، بما في ذلك خطوط الخلايا الأولية التي يصعب نقل المادة الوراثية إليها، ولنقل جزيئات أكبر إليها مثل البلازميدات والبروتينات.

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

هنا نستخدم مكتبة esiRNA الإنسان في شاشة عالية الإنتاجية للجينات لها دور في انقسام الخلايا. نحن لشرح كيفية إعداد وإجراء شاشات esiRNA ، فضلا عن كيفية تحليل والتحقق من صحة النتائج.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

هذا البروتوكول يوفر المعلومات اللازمة لإقامة ورعاية ، وتسجيل من الثقافات وتحفيز كهربائيا على الاتفاقات.

كيفية تسجيل والثقافة والحث على الشبكات العصبية الصغيرة مسرى صالحة (الاتفاقات)

طريقة موثوقة ذات كفاءة...

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

في شبكية هيولي باطني يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي في البروتين والكالسيوم. لقد أنشأنا نظاما التجريبية التي تسمح لنا لمعالجة دور قنوات + CA2 وتسرب لتوصيف آلياتها التنظيمية المفترضة. هذا النظام ينطوي على إسكات الجينات بوساطة سيرنا والخلية الحية CA2 + التصوير.

يعيش التصوير الكالسيوم الخلية المشتركة مع وساطة سيرنا إسكات الجينات يحدد كا 2 + قنوات تسرب في غشاء ER وآلياتها التنظيمية

يوضح الفيديو كيفية استخدام مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) لتسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). يتم تسجيل نشاط الفيزيولوجيا الكهربية من MEA متعدد الآبار الذي يحتوي على ثقافة مشتركة للخلايا العصبية والخلايا النجمية للكشف عن إمكانات العمل من الخلايا العصبية المتعددة في الشبكة ، مما يؤكد التمايز الناجح ل hiPSCs إلى خلايا عصبية.

قياس النشاط الفيزيولوجي الكهربي للشبكات العصبية باستخدام مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة

نصف طريقة لتجارب النضوب والإنقاذ التي تحافظ على السلامة الخلوية وتوازن البروتين. يتيح Adenofection إجراء تحليلات وظيفية للبروتينات داخل العمليات البيولوجية التي تعتمد على الديناميكيات القائمة على الأكتين المضبوطة بدقة ، مثل انقسام الخلايا الانقسامية وتكوين العضلات ، على مستوى الخلية الواحدة.

Adenofection: منهج في دراسة دور الجزيئية الوصيفات في الخلوي Morphodynamics من التجارب استنفاد الانقاذ

ويهدف هذا البروتوكول لشرح كيفية الجمع في المختبر ميكروليكترودي صفائف أجهزة موائع جزيئية لدراسة انتقال إمكانات العمل في الثقافات العصبية. تحليل البيانات، إلا وهي كشف وتوصيف للترويج لإمكانات العمل، يتم تنفيذه باستخدام جديدة متقدمة، بعد سهلة الاستخدام ومتاحة بحرية، أداة حسابية.

ميكروفلويديكس التواصل مع صفائف ميكروليكترودي لدراسة الاتصالات العصبية ونشر إشارة محواري

يصف هذا البروتوكول نقل الخلايا البلازمية عالي الإنتاجية في لوحة تبلغ 384 بئرًا باستخدام تقنية طرد قطرات القطرة الصوتية. وتستغرق وقتا طويلا، وعرضة للخطأ صرف الحمض النووي ومتعددة، ولكن أيضا الاستغناء عن الكاشف transfection، هي البرمجيات التي يحركها جهاز nanodispenser. ثم يتم زرع الخلايا في هذه الآبار المملوءة مسبقا.

عالية الإنتاجية الحمض النووي بلازميد تعدد الإرسال والتحويل باستخدام تكنولوجيا نانوالاستغناء الصوتية

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف منهجية جديدة لقياس معدل إطلاق القلب الجوهري باستخدام تسجيل صفيف microelectrode لأنسجة العقدة الصينية الصناعية بأكملها لتحديد عيوب صنع الإيقاع في الفئران. يمكن أيضا إدخال العوامل الدوائية في هذه الطريقة لدراسة آثارها على صنع الإيقاع الجوهري.

Microelectrode صفيف تسجيل سينواتري عقدة معدل اطلاق النار لتحديد عيوب الإيقاع القلب الجوهرية في الفئران

يسمح الجمع بين التنقيب بالليزر ومصفوفات الأقطاب الدقيقة (MEA) بتسجيلات تشبه إمكانات الفعل لخلايا عضلة القلب الأولية والمشتقة من الخلايا الجذعية المزروعة. يوفر شكل الشكل الموجي رؤية فائقة لطريقة عمل مركبات الاختبار مقارنة بالتسجيلات القياسية. وهو يربط بين مشبك التصحيح وقراءات MEA لزيادة تحسين أبحاث سلامة القلب في المستقبل.

قياسات تشبه إمكانات العمل المستحثة بالليزر لخلايا عضلة القلب على صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة لزيادة التنبؤ بعلم الأدوية الآمن

تعلم طريقة التحويل الموقعي عالي الكفاءة للخلايا اللاصقة باستخدام صفائف المسرى المكروي. تُحسّن هذه التقنية إدخال الحمض النووي الصغير المُتدخل وتُمكّن من فحص التغيرات الظاهرية بدقة عالية في الخلايا المستهدفة.

عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA)

استكشف المزيد من الفيديوهات