تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

تتضمن عملية التواصل الكلاسيكية بين العناصر قبل التشابكية وبعد التشابكية وصول جهد فعل إلى النهاية قبل التشابكية، مما يحفز إفراز الغلوتامات عن طريق زيادة الكالسيوم، وهو ما يؤدي بدوره إلى تنشيط المستقبلات بعد التشابكية. ومع ذلك، فإن ملاحظة أن الخلايا النجمية تتصل اتصالاً وثيقاً بالمشابك العصبية وتعبر عن مستقبلات النواقل العصبية قد غيرت هذه الرؤية إلى مفهوم المشبك الثلاثي. وبالتالي، فإن النقل الغلوتاماتي المستمر سيؤدي أيضاً إلى تنشيط الخلية النجمية وتحفيزها عن طريق ارتفاع الكالسيوم داخل الخلايا.

إن تحرر الناقلات الدبقية، والتي يمكنها بعد ذلك الارتباط بمستقبلات مشبكية أو خارج مشبكية، يعمل على تعديل الأنشطة قبل المشبكية وبعد المشبكية. علاوة على ذلك، تعبر الخلايا النجمية عن نظام الامتصاص الرئيسي للجلوتامات المتحرر مشبكيًا. بالإضافة إلى ذلك، تقوم هذه الخلايا بتطهير البوتاسيوم، الذي يتحرر أثناء إطلاق جهد الفعل والتنشيط اللاحق بعد المشبكي، من النهايات قبل المشبكية وبعد المشبكية عبر قنوات البوتاسيوم الخاصة بها.

يُنقل البوتاسيوم بعد ذلك داخل الخلايا إلى مواقع ذات مستويات بوتاسيوم خارج خلوية أقل، حيث يتم تحريره أو ينتشر عبر الفجوات الموصلة (gap junctions) إلى الخلايا النجمية المجاورة. وبالتالي، ومن خلال التحكم في التركيز خارج الخلوي للمواد النشطة عصبيًا وكذلك من خلال إطلاق الناقلات الشفافة، تلعب الخلايا النجمية أدوارًا مهمة في تحديد قوة النشاط التشابكي. يبحث مختبري في دور التفاعلات العصبية الدبقية في الفسيولوجيا المرضية للدماغ.

لقد استخدمنا هذه التقنية وطورناها بشكل مكثف للكشف عن دور الخلايا النجمية في النقل المشبكي لحظة بلحظة. وبالفعل، تتسم هذه التقنية بالقوة لأنها تتيح مراقبة الاستجابات الكهرومغناطيسية الديناميكية للعصبونات بشكل مباشر ومتزامن. وكما يظهر في عيادة Osteocytes Evap اليوم، سيقوم Ash وJeremy Siebel، الأعضاء في المختبر، بشرح كيفية تنفيذ هذه التقنية وتوضيح كيف تساعدنا في فهم الحوار الوثيق بين العصبونات والخلايا النجمية.

لقد بحثت في تأثير شبكات astroglide على الخلايا العصبية والنقل المشبكي واللدونة من خلال إجراء تسجيلات مزدوجة لنشاط الخلايا العصبية وحدوث نقل البوتاسيوم والغلوتامات في الخلايا النجمية، ووجدت أن التشبيك الخطي يسهل إزالة البوتاسيوم والغلوتامات من الحيز خارج الخلوي أثناء النشاط العصبي. كما بحثت في الخصائص الطبيعية ولدونة حدوث astroglia فيما يتعلق بالفيزيولوجيا العصبية. وخلال تسجيل نشاط astroglia والنشاط العصبي المستحث، تمكنت من تحديد استجابة الخلايا النجمية للتنشيط العصبي، والتي تكون في الغالب عبر تيارات البوتاسيوم.

يمتلك هذا التيار لدنته الكهروفسيولوجية الخاصة، والتي لا تنظم القابلية العصبية واللدونة. وبعبارة أخرى، فإن العد التنازلي للخلايا النجمية هو الأكثر إثارة. Neuros. سنعرض هنا طريقة مهمة لاستقصاء نشاط الخلايا العصبية والخلايا النجمية في آن واحد في شرائح الحصين الحادة من خلال إجراء تسجيلات مزدوجة لتيارات الغشاء النجمي والجهود العصبية المستحثة بواسطة تحفيز الألياف قبل المشبكية.

علاوة على ذلك، سنقوم بإجراء تسجيلات مزدوجة لعصبونات مفردة وخلايا نجمية مجاورة لاستقصاء استجابات Gly في الخلايا النجمية (ASTO) أثناء النشاط العصبي. لقد اخترنا منطقة الحصين لأن هذه المنطقة تظهر تقسيماً تشريحياً ووظيفياً قوياً، وهي موصوفة بدقة من حيث الدوائر العصبية وكذلك النشاط التشابكي واللدونة. ابدأ التجارب بتحضير شرائح دماغ من الحصين، ولهذا قم أولاً بتحضير محلول مُثلج ومؤكسج.

استخدم السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي، قم بتخدير الفئران تخديرًا عميقًا ثم افصل الرأس بسرعة وانقله إلى السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي A CSF. افتح الجمجمة بثلاثة شقوق لفصل نصفي الكرة المخية. وأخيرًا، انقلها إلى سائل A CSF المؤكسج.

اتركه يتمازج بالتساوي لمدة خمس دقائق تقريباً. ابدأ الآن بنصف كرة واحد. يبدأ تشريح الحصين بإزالة الدماغ المتوسط.

يتم الآن توضيح عملية تشريح الحصين بالتفصيل في هذا الشكل. أولاً، ضع نصف الكرة المخية المنفصل على موقعه القشري للوصول إلى الدماغ المتوسط. وباستخدام ملعقتين، قم بإزالة الدماغ المتوسط.

سيكون الحصين الآن مرئياً كما تشير الخطوط المتقطعة. قم بتشريح الحصين باستخدام ملعقة، بدءاً من الـ fia، والتي تظهر كبنية عريضة. أدخل الملعقة أسفل الحصين، وبمساعدة ملعقة ثانية، قم بقطع القشرة المجاورة للحصين.

انقل الحصين إلى طبق زراعة صغير يحتوي على A CSF مؤكسج، ثم انتقل إلى نصف الكرة الثاني. ضع كلا الحصينين على كتلة AGA صغيرة بحيث تكون الجهة السنخية للأعلى. الآن، قم بشفط A CSF المتبقي. قم بلصق الحصين على جهاز غرفة التقطيع.

انقل الحصين إلى غرفة التقطيع وقم بتقطيعه إلى شرائح بسمك 300 أو 400 ميكرومتر. اجمع الشرائح في غرفة تخزين مؤكسجة واتركها لترتاح لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التسجيل في درجة حرارة الغرفة لإجراء تسجيلات شاملة للخلايا النجمية المفردة. انقل شريحة الحصين إلى شريحة غطاء مطلية بالبولي ليسين.

قم بتجفيف فائض A CSF للسماح بالتصاق شريحة الحصين بغطاء الشريحة المطلي بالبولي، ثم أضف A CSF مرة أخرى فوق الشريحة. انقل الشريحة إلى غرفة التسجيل، التي يتم ترويتها باستمرار بـ A CSF مؤكسج بسرعة تروية تتراوح بين 1 إلى 2 mL في الدقيقة. ولتحديد الخلايا النجمية، يمكن استخدام الفئران التي تعبر عن EGFP تحت محفز GFAP الخاص بالخلايا الدبقية النجمية لإجراء تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp).

املأ أنبوباً زجاجياً بمقاومة تتراوح بين 4 إلى 6 mega ohms بمحلول داخل خلوي بارد ومفلتر، وذلك باستخدام محلول داخل خلوي يحتوي على rhodamine، حيث يمكنك رؤية الخلية النجمية التي تم إجراء الرقعة لها باللون الأحمر وباللون الأخضر. تظهر الخلايا النجمية المجاورة وهي تعبر عن EGFP. وتحت محفز GFAP، يمكن التعرف على الخلايا النجمية من خلال صغر حجم أجسامها التي تبلغ حوالي 10 micrometer وتفرع عملياتها الرئيسية، والتي تشتمل عادةً على ثلاثة إلى أربعة فروع.

تسمح حقنة متصلة عبر أنبوب بالماصة بتطبيق ضغط إيجابي أثناء الهبوط في النسيج؛ في نافذة الأوامر، قم بتفعيل نبضة اختبار بقيمة 10 millivolt وتصفير تيار التثبيت. بعد ذلك، حرك الماصة بمساعدة المجهر الدقيق (Micro manipulator) داخل النسيج للاقتراب من الخلية. وعند الوصول إلى سطح الخلية، نتحرك بشكل إضافي حتى نرى انبعاجاً يظهر على شكل انحراف ضوئي، مما يشير إلى حدوث تشوه بسيط في سطح الخلية.

بسبب تطبيق الضغط الإيجابي، سيلتصق غشاء الخلية النجمية الآن بإحكام بفتحة طرف الماصة الزجاجية، وهو ما يمكن ملاحظته من خلال زيادة المقاومة عند الوصول إلى ختم جيجا (giga seal). قم بإجراء تعويض السعة الكهربائية من خلال الدخول إلى تكوين الجملة عبر التطبيق اللطيف للضغط السلبي مع مراقبة أجزاء الاختبار في نافذة الأوامر. وسيكون الاختراق إلى داخل الخلية مرئياً من خلال تدفق التيار عبر الغشاء.

يتيح تطبيق سلسلة من خطوات الجهد مفرطة الاستقطاب ومزيلة الاستقطاب توصيف خصائص غشاء الخلية، حيث تظهر الخلايا النجمية عادةً استجابات تيار خاملة فقط. ولا يؤدي حقن التيار في وضع تثبيت التيار (Current clamp mode) إلى توليد جهد فعل، مما يؤكد بشكل إضافي أنك قد نجحت في تثبيت خلية نجمية. كما أن إضافة مادة تتبع مثل السلفور أو دومين B إلى ماصة التثبيت تتيح تصور الخلية النجمية المثبتة.

علاوة على ذلك، يتيح الانتشار السلبي للمقتفي لمدة 20 دقيقة في وضع تثبيت التيار (current clamp mode) تصور الخلايا النجمية المجاورة المتصلة عبر الفجوات الموصلة (gap junctional) لإجراء تسجيلات مزدوجة للنقل العصبي الاستثاري، والتي تليها تيارات نجمية مستحثة. نقوم أولاً بحجب النقل التثبيطي باستخدام precor toin لمنع فرط الاستثارة، الذي يحدث في حالة غياب النقل GABAergic. ثم نقوم بقطع الاتصالات التي تتوسطها الشرايين الجانبية (shaer collaterals) بين CS three و C one باستخدام سكين قزحية صغيرة.

نقوم بعد ذلك بوضع قطب تحفيز المجال A CSF، وقطب تسجيل المجال، وقطب تثبيت الرقعة الخلوية (patch clamp) للخلايا النجمية. وفي شريحة الحصين، نختار خلية نجمية ونضع قطب المجال على بُعد 200 micrometer منها لضمان أن الخلية النجمية تدمج بالفعل النشاط المسجل بواسطة تحفيز قطب المجال لشوكات شافر (Shafer collaterals) الذي سيؤدي إلى استثارة جهد مجال تحفيزي. يتكون جهد المجال هذا من جدار الألياف الذي يعكس عدد المحاور العصبية المحفزة، وما يليه من إزالة الاستقطاب بعد التشابكي لإجراء تسجيلات مزدوجة لجهود التغذية العصبية واستجابات تيار الخلية الكاملة للخلايا الدبقية النجمية.

أولاً، قم بوضع قطب تسجيل المجال على مسافة 50 µm تقريباً من الخلية النجمية المختارة. ثم حرك قطب الرقعة (patch electrode) إلى جسم الخلية النجمية وقم بإجراء تثبيت الرقعة (patch clamp)، مع التحقق من أن الخلية المختارة هي بالفعل خلية نجمية من خلال خصائص غشائها السلبية. الآن، ومن خلال تحفيز Shaer Cs، يمكننا تسجيل النشاط العصبي والتيار النجمي اللاحق في آن واحد، والذي يتكون من استجابة طويلة الأمد تصل إلى 50 pO بسبب ترابط الشبكة وحقيقة أن الخلية النجمية الواحدة تتصل بمشابك عصبية تصل إلى 100 عصبون.

تدمج هذه الخلايا نشاط عدد كبير من المشابك العصبية التي يتم تنشيطها في وقت واحد لإجراء تسجيلات مزدوجة للخلية الكاملة لعصبونات فردية وخلايا نجمية مجاورة، وذلك من خلال إنزال قطبين للتثبيت (patch electrodes) في منطقة الطبقة (stratum) من شريحة الحصين. حدد في المنطقة C عصبوناً مستهدفاً، وفي نفس العمق وعلى بعد حوالي 20 إلى 60 ميكرومتر، حدد خلية نجمية، ثم ضع كلا الماصتين على ارتفاع حوالي 10 ميكرومتر فوق كل خلية مع تطبيق ضغط إيجابي. يجب وضع ماصة تسجيل الخلايا النجمية في أقرب نقطة ممكنة من الخلية النجمية المستهدفة لتجنب أي تحركات ميكانيكية إضافية.

أولاً، قم بتحقيق ختم gga على العصبون. انتقل الآن إلى إجراء عملية الترقيع (patching) للخلية النجمية، والتي عادةً ما يكتمل ختمها بشكل أبطأ من العصبونات. ولتلخيص الخطوات الهامة لإجراء التسجيلات المزدوجة الشاملة، قم أولاً بخفض أنبوبي التسجيل داخل الشريحة.

اقترب من جسم الخلية للنجمية، ثم قم بإجراء الختم الزجاجي (gga seal) على العصبون، وأنهِ العملية بإجراء الختم الزجاجي على الخلية النجمية؛ فعادةً ما تمتلك العصبونات مقاومة غشائية أعلى بكثير من الخلايا النجمية، والتي تبلغ في العصبونات الهرمية حوالي 200 إلى 500 mega عند وجود الخليتين معاً. الآن، في وضع تثبيت الجهد (voltage clamp) مع فرط الاستقطاب، يتم تنشيط تيارات الصوديوم العابرة في العصبون واستجابات البوتاسيوم السلبية في الخلية النجمية. نوضح هنا أن تحفيز الجهد الميداني لما بعد التشابكي الاستثاري السريع عن طريق تحفيز الشجيرات الجانبية (shaa collaterals) يستحث استجابة تيار لاحقة طويلة الأمد.

في الخلايا النجمية المجاورة، يكشف تثبيط مستقبلات الغلوتامات الأيونية باستخدام حمض الريميك أن غالبية تيار ASTO GLY يعود إلى التنشيط ما بعد التشابكي الاستثاري. وتتكون استجابة B AIC المتبقية من حدوث نقل سريع وعابر للغلوتامات يكون حساساً لـ TBOA، وتيار صغير طويل الأمد، يرجح أن يكون ناتجاً عن إطلاق البوتاسيوم قبل التشابكي أثناء جهد الفعل. ويراقب تيار ASCITIC بدقة عالية النشاط ما بعد التشابكي نظراً لأن كليهما يزداد خطياً مع زيادة النشاط قبل التشابكي.

علاوة على ذلك، تظهر التيارات النجمية استجابات شبيهة بالاستجابات العصبية، وهي تيسير النبض المزدوج. حيث يؤدي التحفيز الفردي المعتدل للتفرعات الشاركية إلى إحداث تيار نجمي مستحث مشبكياً كبيراً نسبياً مقارنة بإزالة الاستقطاب المستحثة الصغيرة التي يتم تسجيلها في الخلية نفسها في وضع تثبيت التيار. ويعود ذلك إلى انخفاض مقاومة الغشاء في الخلايا النجمية.

يعد تسجيل ديناميكيات جهد الغشاء لـ TTO gly المستثار تشابكياً مقياساً مباشراً لمستويات البوتاسيوم خارج الخلية المحلية؛ فمن خلال إجراء تسجيلات مزدوجة لعصبون وخلية نجمية مجاورة، لاحظنا عدم وجود استجابة تيار خلوي نجمي أثناء إطلاق العصبون لجهد الفعل، مما يشير إلى عدم وجود اقتران كهربائي بينهما. كما أن جهد ما بعد التشابك الاستثاري المستثار في منطقة CS three يثير أيضاً استجابات تيار في الخلايا النجمية. بالإضافة إلى ذلك، أدى التحفيز لمرة واحدة إلى تعزيز الاستجابة العصبونية في منطقة CS three بشكل قوي، بينما أدى إلى زيادة التيار النجمي بشكل متوسط فقط.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لدينا فهم أفضل لكيفية إعداد وإجراء تسجيلات كهروفيزيولوجية مزدوجة ناجحة للخلايا العصبية والخلايا النجمية. باستخدام هذه التقنية، يمكنك دراسة الإشارات الديناميكية المباشرة بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية للاستجابة الكهروفيزيولوجية التي تهمك. وبشكل خاص، يمكنك استقصاء ما إذا كانت تفاعلات GL الجديدة التي تشمل وظائف القنوات الأيونية وتعديلاتها تساهم في تحديد الحالات الفسيولوجية أو المرضية.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.