Name: الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: تعلم عزل خلايا T النادرة المحددة للإبيتوب باستخدام رباعي الببتيد:MHC والخرز المغناطيسي من خلايا لمفاوية فأرية. تُحسّن هذه الطريقة فهم الاستجابات المناعية الطبيعية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر اندريه هان والين لورانس للمساعدة التقنية، وأعضاء المختبر جنكينز للمساعدة في تطوير هذا البروتوكول.

1. عزل الخلايا من الأنسجة اللمفاوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الجليد الباردة cEHAA (+ 10٪ EHAA FBS، القلم / بكتيريا، جنتاميسين، 2 مم L-الجلوتامين، 55 مم 2-المركابتويثانول) أو غيرها من الخلايا T المتوسطة ما يعادلها، إلى صحن الثقافة 60 مم يحتوي على مربع صغير من 100 شبكة النايلون ميكرومتر ومكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطحال والغدد الليمفاوية ما يصل يمكن الوصول إليها بسهولة ممكن. ينبغي أن تشمل هذه على الأقل، الإبطين الأربية، العضدية، والعقد اللمفاوية العنقية، والمساريقي. وضعها على رأس شبكة النايلون في طبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الأعلى المسطح من 1،5 أنبوب مغلق microfuge مل، الهريس بلطف الأنسجة اللمفاوية خلال شبكة من النايلون لتحرير الخلايا الليمفاوية. إضافة 1 مل من آخر cEHAA والماصة صعودا وهبوطا للعمل الخلايا في التعليق. نقل الخلايا من خلال قطعة أخرى من النايلون وضعت على شبكة أعلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل مادة البولي بروبيلين. شطف الأطباق وشبكة مع آخر 1 مل من الجليد الباردة cEHAA، صأولينغ وحدات التخزين في أنبوب واحد. تكرار لتحقيق التعليق الخلية النهائي حجم 4 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة العازلة فارز (PBS + 2٪ FBS، أزيد 0.05٪) إلى الحجم النهائي من 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في كتلة FC (فارز عازلة + 2.4G2 الضد) إلى وحدة تخزين النهائي يساوي تقريبا ضعف من بيليه نفسه. على سبيل المثال، الطحال والغدد الليمفاوية على فأرة الحاسوب ساذجة تنتج عادة بيليه خلية من حوالي 100 ميكرولتر. في هذه الحالة، إضافة 100 ميكرولتر من كتلة التيسير لتبرزي حجم إلى 200 ميكرولتر. إذا كان درجة كبيرة من التثاقل خلية حدث، وإزالة بعناية تتجمع الخلايا في هذه المرحلة مع طرف الماصة. </li></ol> 2. Tetramer تلوين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة PE-APC-المسمى أو PMHC tetramer إلى تركيز النهائي من 10 نانومتر (أو تركيز الأمثل تجريبيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومزيج incubaالشركة المصرية للاتصالات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (أو الوقت الأمثل تجريبيا ودرجة الحرارة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. الحفاظ على العينات على الجليد أو عند 4 ° C من الآن فصاعدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. لتخصيب tetramer مزدوجة، إعادة تعليق النهائية إلى وحدة تخزين من 150 ميكرولتر. </li></ol> 3. المغناطيسية التخصيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من microbeads Miltenyi مكافحة PE أو مكافحة APC. لتخصيب tetramer مزدوجة، إضافة 50 ميكرولتر من كل من. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء انتظار، إعداد عمود LS Miltenyi المغناطيسي المغناطيس على MidiMACS أو QuadroMACS. وضع مفتوح البولي بروبلين 15 مل أنبوب الطرد المركزي علىرف مباشرة تحت العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من العازلة فارز إلى أعلى العمود، والسماح لها لاستنزاف في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع النايلون مساحة 100 ميكرومتر شبكة على رأس العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تنتهي من الخلايا الغزل ونضح بعناية طاف بيليه و resuspend في 3 مل من العازلة فارز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل التعليق الخلية من خلال شبكة من النايلون على الجزء العلوي من العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما توقف خلية استنزفت تماما في العمود، وشطف الأنبوب الأصلي مع آخر مل 3 من فارز العازلة ونقل المخزن المؤقت من خلال شبكة من النايلون في العمود، الشطف شبكة في هذه العملية. تجاهل شبكة النايلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما استنزفت تماما عازلة في العمود، إضافة آخر مل 3 من المخزن المؤقت فارز إلى العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 10 لما مجموعه 3 مل يغسل X 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عمود من المغناطيس ومكان أكثر من أنبوب جديد 15 مل الطرد المركزي البولي بروبلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من العازلة فارز لرانه العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج فورا الغواص في أعلى العمود في واحد وحركة مستمرة، ودفع المكبس على طول الطريق، مما اضطر العازلة من العمود في أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي أنابيب تحتوي على جزء محدد مزال وجزء غير منضم التدفق من خلال لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف من الكسر محدد، مع التأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 95 ميكرولتر بالضبط. نضح و resuspend الكسر غير منضم إلى الحجم النهائي من 2 مل. </li></ol> 4. تدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل جزء، وإزالة وإضافة 5 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر من الخرز العد (معدلة لتركيز مل / 200،000 في المخزن المؤقت فارز) في أنبوب مل 5 FACS. توضع جانبا في 4 لتحليل C ° في وقت لاحق. لتوفير الوقت، يمكن الخرز مسبقا aliquoted لأنابيب المسمى قبل بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد صباحاأستر مزيج من الأجسام المضادة لعلامات وصمة عار على سطح الخلايا (الجدول 1). لتوفير الوقت، ويمكن أن يتم ذلك قبل بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجزء محدد، إضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل مباشرة إلى ميكرولتر من 90 ~ الخلايا في الأنبوب. إذا هو المطلوب تحليل الكسر غير منضم، بتحويل 90 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب 5 مل FACS وإضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل لجنة للضوابط التعويض أحادية اللون لتدفق عداد الكريات. لكل ملون تألقي لاستخدامها، مزيج 50 ميكرولتر من الخلايا بقايا جزء غير منضم في أنبوب مل 5 FACS مع 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD4 مترافق إلى ملون تألقي المقابلة. تذكر لإنشاء عنصر تحكم غير ملوثين أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة واحتضان جميع العينات لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من العازلة فارز لكل أنبوب الطرد المركزي ولمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجزء محدد، نضح بعناية طاف و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من BUF فارزFER. نقل الخلايا إلى microtube 1،2 مل FACS. شطف الأنبوب مع آخر ميكرولتر العازلة 200 من فارز والمسبح في نفس microtube. إذا كتل الخلايا واضحة، تمر الخلايا من خلال مرشح ميكرون 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجزء غير منضم وضوابط التعويض، أو صب نضح طاف و resuspend في فارز 2 مل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قياس التدفق الخلوي باستخدام عناصر التحكم التعويض أحادية اللون. حدد الجانب مبعثر ذات العرض (SSC-W) كمعلمة إضافية ليتم تسجيلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عينات الملون باستخدام سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة CD4 + لتحديد أو CD8 + T الخلايا كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. لكسور محدد، جمع خلايا أكبر عدد ممكن بحد أقصى 2،000،000 مجموع الأحداث. لكسور غير منضم، وجمع 1000000 مجموع الأحداث. الحفاظ على معدل الاستحواذ في 3000 أو أقل الأحداث في الثانية الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إعدادات الجهاز نفسه، وتحليل عينات العد حبة. جمع 10000 مجموع الأحداث. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ كافة البيانات في ملفات FCS. </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل FCS ملفات البيانات لعينات العد باستخدام حبة FlowJo البرمجيات. مبعثر مؤامرة قدمها FITC ووضع بوابة أرونج عد حبات (أنظر الشكلين 1 و 2). تحديد العدد الإجمالي للعد الخرز الكشف عن في كل عينة. طرح من إجمالي عدد الأحداث التي تم جمعها لتحديد عدد الخلايا التي تم جمعها من الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب العدد الإجمالي للجميع الخلايا في كل عينة باستخدام المعادلات المبينة في الإطار 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل FCS ملفات البيانات لعينات الملون جزء محدد وغير منضم. إعداد سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة لتحديد اللمفاوية +، لو الجانبية مبعثر العرض، تفريغ، CD3 +، + CD4 CD8 + أو، tetramer + الخلايا التائية في كل عينة كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضاعفة العدد الإجمالي للخلايا في العينة من الترددات لكل من بوابات إدراج تستخدم لتحديد CD4 + tetramer+ + CD8 أو tetramer + الخلايا لحساب العدد الإجمالي للخلايا T-حاتمة محددة (الإطار 1). </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8%2B+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li>
<li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+3+domain+mutants+of+peptide%2FMHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li>
<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وtetramer PMHC تخصيب خلية مقرها طريقة التي قدمها هذا البروتوكول هو أداة قوية لدراسة حاتمة محددة خلايا T من الخلايا T الذاتية ذخيرة. استخدام tetramers PMHC تمكن الكشف عن خلايا T حاتمة محددة تستند مباشرة على قدرة TCRs لربط يغاندس PMHC وما شابه ذلك. إثراء يوفر مستوى من الحساسية بحيث يمكن الكشف عن السكان نادرة للغاية من الخلايا T-مستضد محددة من ذخيرة الذاتية من الخلايا T دون اي مس تكوينهم الوراثي أو تردد السلائف. ونتيجة لذلك، وهذا الأسلوب يسمح المحقق لتتبع مباشرة الذاتية مستضد محددة ا...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; الكاشف</strong</td&gt;<td<strong&gt; البائع</strong</td&gt;<td<strong&gt; كتالوج عدد</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE أو APC مترافق PMHC tetramer (أو متعدد القسيمات)</td&gt;<td&gt; صنع من قبل المحقق، تم الحصول عليها من المعاهد الوطنية للصحة الأساسية tetramer، أو تم شراؤها من مصادر تجارية</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مكافحة PE microbeads المغناطيسي مترافق</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مكافحة APC microbeads المغناطيسي مترافق</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الأعمدة LS المغناطيسي</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS أو المغناطيس QuadroMACS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 أو 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الخرز خلية العد</td&gt;<td&gt; الحياة تكنولوجيز</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

الببتيد: mhc tetramer القائم على إثراء خلايا t حاتمة محددة

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

ضرورة أساسية للباحثين الذين يدرسون الحصانة التكيف مع نماذج تجريبية في الجسم الحي هو القدرة على تحديد الخلايا T T بهم على أساس خلية مستقبلة المستضد (TCR) خصوصية. العديد من الطرق غير المباشرة التي تتوفر في عدد سكانها ويتم تحفيز الخلايا T الأكبر من في المختبر مع مستضد معين وحاتمة محددة خلايا T وتحديدها من خلال قياس استجابة وظيفية مثل انتشار الأسلحة النووية، إنتاج السيتوكينات، أو التعبير عن علامات التنشيط 1. ومع ذلك، هذه الأساليب تحديد حاتمة محددة فقط خلايا T واظهار واحدة من العديد من الوظائف المحتملة، وأنها ليست حساسة بما يكفي للكشف عن خلايا محددة حاتمة T على ترددات السلائف السذاجة. وثمة بديل شعبية هو المعدلة وراثيا TCR نموذج نقل بالتبني، والتي هي خلايا T المصنف حيدة النسيلة من الماوس المعدلة وراثيا في TCR المضيفين متوافق نسيجيا لخلق السكان السلائف كبير من الخلايا T-حاتمة محددة يمكن أن تكون EASIلي مع تعقب استخدام الأجسام المضادة علامة 2،3 مسانج مشترك. بينما قوية، وهذه الطريقة يعاني من التحف التجريبية المرتبطة تردد من الخلايا T unphysiological مع خصوصية لحاتمة واحدة 4،5. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن تستخدم هذا النظام للتحقيق في عدم التجانس الوظيفي للحاتمة محددة استنساخ الخلايا T للسكان من بولكلونل. يجب أن الطريقة المثلى لدراسة الحصانة التكيف تنطوي على الكشف المباشر للحاتمة محددة خلايا T T من مرجع الخلية المحلية باستخدام أسلوب الذي يميز خصوصية TCR فقط من قبل ملزم لالمشابهة الببتيد: مجمعات MHC (PMHC). استخدام tetramers PMHC والتدفق الخلوي يحقق هذا 6، ولكن يقتصر على الكشف عن السكان تيرة عالية من الخلايا T-حاتمة محددة لا توجد إلا مستضد التالية التي يسببها التوسع نسيلي. في هذا البروتوكول، ونحن تصف الطريقة التي تنسق استخدام tetramers PMHC وماغنيتيك تكنولوجيا تخصيب الخلية لتمكين الكشف عن خلايا T التردد المنخفض للغاية حاتمة محددة من الأنسجة اللمفاوية 3،7 الماوس. مع هذه التقنية، يمكن للمرء أن تتبع شامل كامل حاتمة محددة من الخلايا T السكان الذاتية في الفئران في جميع مراحل الاستجابة المناعية.

الشكل 1 يصور ممثل المؤامرات التدفق الخلوي من الطحال pMHCII المخصب tetramer وعينات من الفئران العقدة الليمفاوية السذاجة، بينما يصور الشكل 2 بيانات تمثيلية للتحصين الفئران سابقا مع الببتيد ذات الصلة + CFA. مسلسل الأحداث النابضة يزيل autofluorescent غير المرغوب فيها وغيرها من CD4 + تحليل السكان خلية T. وCD8 + T الخلية السكان بمثابة السيطرة مفيدة السلبية الداخلية لتلطيخ tetramer pMHCII من CD4 + الخلايا التائية. نلاحظ أن الكسور متجهة من تخصيب عادة ما ت...

يصف هذا البروتوكول استخدام الببتيد: MHC tetramers وmicrobeads المغناطيسي لعزل السكان التردد المنخفض من الخلايا T-حاتمة محددة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تمكن من الدراسة الذاتية المباشرة السكان خلية T من الاهتمام من<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; أنظمة التجريبية.

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

تعد القدرة على تحديد الخلايا التائية بناءً على... الخلايا التائية ضرورة أساسية للباحثين الذين يدرسون المناعة التكيفية باستخدام نماذج تجريبية في الجسم الحي.

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد الخلايا التائية النادرة المتخصصة في مستضد معين (epitope specific T cells) من مجموعة الخلايا التائية الداخلية في الفئران. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق صبغ الخلايا اللمفاوية التي تم جمعها باستخدام كواشف رباعية MHC الببتيدية (peptide MHC tetramer reagents)، والتي ستعمل على وسم الخلايا التائية ذات الصلة والمتخصصة في المستضد بفلورية. بعد ذلك، يتم صبغ هذه الخلايا الموصومة بالرباعيات باستخدام خرزات مجهرية مغناطيسية مقترنة بأجسام مضادة متخصصة في الوسم الفلوري الموجود على الرباعية.بعد ذلك، يتم تمرير الخلايا الموصومة مغناطيسيًا عبر عمود ممغنط من أجل إثراء العينة بالخلايا التائية المتخصصة في مستضد محدد والمرتبطة بالرباعيات (tetramers). وأخيرًا، يتم صبغ الخلايا بعلامات خلوية تجريبية مطلوبة، ثم يُجرى تحليل التدفق الخلوي متعدد المعلمات للكشف عن تجمعات الخلايا التائية النادرة المتخصصة في مستضد محدد والمُثراة بالرباعيات وتقديرها كميًا. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية الأخرى، مثل نظام النقل التبني لـ TCR Transgenic T-cell، في أن الدراسات تُجرى على تجمعات متعددة النسائل حقيقية من الخلايا التائية المتخصصة في مستضد محدد والتي تتطور بشكل طبيعي داخل الجهاز المناعي.علاوة على ذلك، فإن الحساسية العالية للكشف التي توفرها هذه التقنية تتيح دراسة هذه المجموعات الخلوية عندما تكون موجودة بترددات منخفضة للغاية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على العديد من الأسئلة الجوهرية في مجال علم المناعة، مثل عدد الخلايا التائية الساذجة (naive T cells) التي قد تتعرف على مستضد معين من ميكروب ممرض، وكيف يتغير التركيب النسيلي لمجموعة من الخلايا التائية المتخصصة في حاتمة معينة طوال فترة الاستجابة المناعية. قبل البدء في عملية التشريح، أضف 1 mL من وسط EHAA الكامل إلى طبق زراعة بقطر 60 mm يحتوي على مربع صغير من شبكة النايلون بمسامية 100 micron، وضع الطبق على الثلج.بعد ذلك، قم بإزالة الطحال من فأر تم قتل رحيم، وأكبر عدد ممكن من العقد اللمفاوية التي يسهل الوصول إليها. ضع الأنسجة فوق الشبكة النايلونية في طبق الزرع. استخدم الجزء العلوي المسطح لأنبوب طرد مركزي دقيق مغلق سعة 1.5 millimeter لسحق الأنسجة اللمفاوية بلطف فوق الشبكة النايلونية.لتحرير الخلايا الليمفاوية، أضف ميليلتر آخر من الوسط الغذائي إلى الطبق، ثم اسحب المحلول بالماصة صعوداً وهبوطاً لتحويل الخلايا إلى معلق. الآن، ضع مصفاة نايلون جديدة فوق أنبوب طرد مركزي بولي بروبيلين سعة 15 ميليلتر، ثم انقل الخلايا عبر المصفاة الجديدة. اشطف الطبق والمصفاة بميليلتر آخر من الوسط الغذائي البارد واسحب الكميات عبر قطعة المصفاة الجديدة إلى أنبوب الـ 15 ميليلتر.كرر عملية الشطف مرة أخرى. بعد إضافة محلول منظم للفرز (sorter buffer) بارد حتى يصل الحجم النهائي إلى 15 milliliters، قم بطرد مركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 300 ×g و 4 °C. ثم اسحب الرائق (supernatant) بعناية.قم بتعليق كتلة الخلايا في FC block وصولاً إلى حجم نهائي يعادل ضعف حجم الكتلة تقريباً. في حال حدوث درجة كبيرة من تكتل الخلايا، قم بإزالة تكتل الخلايا بعناية باستخدام طرف ماصة لصبغ الخلايا التائية النوعية للمستضد.أضف رباعي القسيمات (tetramer) لـ MHC والببتيد المسمى فلوريسنتياً إلى كتلة الخلايا المعاد تعليقها بالتركيز الأمثل. بعد ذلك، اخلط معلق الخلايا وحضنه للمدة ودرجة الحرارة المثليتين لربط رباعي القسيمات. بعد ذلك، أضف منظم فرز بارد (sorter buffer) لرفع الحجم إلى 15 milliliters وقم بالطرد المركزي مع الحفاظ على الخلايا عند درجة حرارة 4 °C.قم الآن بسحب السائل الطافي بعناية. بعد ذلك، أعد تعليق كتلة الخلايا في محلول منظم للفرز (sorter buffer) حتى يصل الحجم النهائي إلى 200 microliters. أضف الآن 50 microliters من الخرزات الدقيقة المقترنة بأجسام مضادة من نوع miltenyi، والتي سترتبط تحديداً بالعلامة الفلورية لخليط التيتramer، ثم قم بحضن الخلايا المرتبطة بالتيتramer والخرزات عند درجة حرارة أربع degrees Celsius.بعد مرور 20 دقيقة، اغسل الخلايا باستخدام محلول تنظيم الفرز (sorter buffer) أثناء وجود الخلايا في جهاز الطرد المركزي. ضع عمود milani LS المغناطيسي على مغناطيس quadro max، ثم ثبت أنبوب طرد مركزي جديد من البولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول تنظيم الفرز مباشرة فوق العمود، مع السماح للمحلول بالتصريف في أنبوب الـ 15 ملليلتر الموجود أسفل العمود.بعد ذلك، ضع مربعاً من شبكة النايلون بمسامية 100 micron فوق العمود. وعندما تنتهي عملية طرد الخلايا مركزياً، اسحب السائل الطافي بعناية وأعد تعليق الرواسب في ثلاثة ملليلتر من sorter buffer، ثم انقل معلق الخلايا عبر شبكة النايلون إلى أعلى العمود. وعندما يتصرف معلق الخلايا بالكامل داخل العمود، اشطف الأنبوب الأصلي بثلاثة ملليلتر أخرى من sorter buffer وانقلها عبر الشبكة إلى العمود.بعد تجميع سائل الغسيل في أنبوب التجميع، تخلص من الشبكة النايلونية. وبمجرد تصريف المحلول المنظم بالكامل في الأنبوب، اغسل العمود مرتين إضافيتين باستخدام 3 milliliters من محلول فرز الخلايا (sorter buffer) في كل مرة. ثم انزع العمود من المغناطيس وضعه فوق أنبوب طرد مركزي جديد من البولي بروبيلين سعة 15 milliliter.أضف الآن خمسة ملليلترات أخرى من محلول الفرز المنظم (sorter buffer) إلى العمود. أدخل المكبس فوراً في الجزء العلوي من العمود، وبحركة واحدة مستمرة، ادفع المكبس إلى الأسفل تماماً، مما يؤدي إلى دفع المحلول المنظم خارج العمود إلى الأنبوب. بعد إجراء عملية الطرد المركزي لكل من الأنبوب الذي يحتوي على الجزء المرتبط المستخلص والأنبوب الذي يحتوي على الجزء غير المرتبط المار (flow through)، اسحبそそسائل الطافي بعناية من الجزء المرتبط وأعد تعليق كتلة الخلايا في محلول الفرز المنظم حتى يصل الحجم النهائي إلى 95 µL بالضبط، ثم اسحب وأعد تعليق الجزء غير المرتبط ليصل الحجم النهائي إلى 2 mL قبل المتابعة في صبغ أجزاء الخلايا، ثم أضف 200 µL من خرزات العد (counting beads) في أنبوب fax سعة 5 mL وانقل 5 µL من الخلايا إلى هذا الأنبوب.اترك هذه الأنابيب جانبًا في درجة حرارة 4 °C للتحليل. لاحقًا، قم بتحضير خليط رئيسي (master mix) من الأجسام المضادة لصبغ العلامات السطحية على الخلايا وفقًا للجدول. بالنسبة للجزء المرتبط، أضف جرعة من كوكتيل الأجسام المضادة مباشرة إلى الخلايا بالنسبة للجزء غير المرتبط.انقل 90 µL من الخلايا إلى أنبوب fax سعة 5 mL، وأضف جرعة من مزيج الأجسام المضادة إلى العينة المنقولة لكل فلوروكروم سيتم استخدامه. اخلط 50 µL من الجزء المتبقي من الخلايا غير المرتبطة في أنبوب fax سعة 5 mL مع 1 µL من الجسم المضاد anti CD four المقترن بالفلوروكروم المناسب. قم بتجهيز عينة ضابطة غير مصبوغة أيضاً، ثم قم برج جميع العينات بجهاز vortex، وبعد ذلك حضن جميع العينات عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك، وبعد غسل كل أنبوب في 5 mL من محلول الفرز المنظم (sorter buffer)، اسحب carefully الطافي من عينات الجزء المرتبط، وأعد تعليق الخلايا في 200 µL من محلول الفرز المنظم. انقل الخلايا إلى أنابيب دقيقة سعة 1.2 mL، ثم اشطف أنابيبهم السابقة بـ 200 µL أخرى من محلول الفرز المنظم، مع تجميع نواتج الشطف في الأنابيب الدقيقة المقابلة. وفي حال ظهور تكتلات، مرر الخلايا عبر مرشح 50 micron للجزء غير المرتبط وضوابط التعويض، ثم اسكب الطافي وأعد تعليق الرواسب في 1 mL من محلول الفرز المنظم.قم بتحليل العينات المصبوغة باستخدام سلسلة من بوابات الاحتواء المتتالية لتحديد الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 أو الموجبة لـ CD8، كما هو موضح هنا لعينات الجزء المرتبط. اجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا بحد أقصى 2 million من الأحداث الإجمالية لعينات الجزء غير المرتبط. اجمع 1 million من الأحداث الإجمالية.أخيرًا، وباستخدام إعدادات الجهاز نفسها، يتم جمع 10,000 حدث من عينات خرزات العد. يوضح الشكل الأول مخططات قياس التدفق الخلوي الممثلة لعينات الطحال والعقد الليمفاوية المثرية برباعيات MHC two الببتيدية من فئران ساذجة لكسور الخلايا المرتبطة وغير المرتبطة. تم وضع سلسلة من البوابات لاختيار الأحداث ذات التشتت اللمفاوي الإيجابي والتشتت الجانبي مع استبعاد الخلايا غير المرغوب فيها (dump negative) وإيجابية CD three؛ ومن هذه الأحداث، تم تحديد الخلايا إيجابية CD four أو إيجابية CD eight لتحليل الخلايا التائية النوعية للحواتم أو صبغة الخلفية.تم خلط حصص من الخلايا غير المصبوغة من الأجزاء المرتبطة وغير المرتبطة مع حبيبات عدّ فلورية وحُللت بشكل منفصل. وتصور مخططات الكثافة هذه بيانات ممثلة للفئران التي تم تحصينها مسبقاً بالببتيد ذي الصلة بالإضافة إلى مادة مساعدة كاملة. وقد استُخدمت استراتيجية البوابات التسلسلية ذاتها المتبعة في التجربة السابقة لإزالة أي فلورية ذاتية وأي أحداث أخرى غير مرغوب فيها.من خلال تحليل مجموعات الخلايا التائية الموجبة لـ CD4، كانت مجموعة الخلايا التائية الموجبة لـ CD8 بمثابة ضابط داخلي سلبي مفيد لصبغ رباعي MHC two الببتيدي للخلايا التائية الموجبة لـ CD4. تُحسب الأعداد المطلقة للخلايا التائية النوعية للحاتمة في العينة من خلال ضرب العدد الإجمالي لجميع الخلايا في الجزء المرتبط من العينة المثرية، كما تم تحديده من تحليل عدد الخرزات، في نسبة هذه الخلايا الموجبة للرباعي كما تم تحديدها من تحليل صبغ الخلايا؛ وبالنسبة لبيانات الفأر الساذج التمثيلية الموضحة في السلسلة الأولى من مخططات الكثافة، كان إجمالي عدد الخلايا 4,411، وكان عدد الخرزات 5,589. وكان تركيز مخزون الخرزات 2 × 10⁵ لكل ملليلتر.كان حجم الخرز 0.2 milliliters وحجم الخلايا 0.005 milliliters. وبناءً على ذلك، استُخدمت هذه البيانات لحساب تركيز الخلايا وهو 6.31 × 10⁶ لكل milliliter. ثم ضُرِب تركيز الخلايا في الحجم الكلي للعينة لاستخراج العدد الكلي للخلايا.وبدورها، ضُربت هذه البيانات في النسبة المئوية للأحداث الإيجابية للرباعي (tetramer) من تحليل الخلايا لتحديد أن عدد خلايا T الإيجابية لـ CD4 والخاصة بالحاتمة من هذه الفأرة الساذجة كان 98. أما بالنسبة لبيانات الفأرة المحصنة الممثلة في السلسلة الثانية من مخططات الكثافة، فقد كان العدد الإجمالي لخلايا T الإيجابية لـ CD4 والخاصة بالحاتمة 1.53 × 10⁴. وتنخفض كفاءة الإثراء كلما زاد عدد خلايا T الخاصة بالحاتمة.لذا، قد تظهر الخلايا الموجبة للتيترايمر في الجزء غير المرتبط من العينات التي تحتوي على ترددات عالية جداً من الخلايا التائية النوعية للإبيتوب. وفي مثل هذه الحالات، يمكن حساب عدد الخلايا التائية النوعية للإبيتوب الموجودة في الجزء غير المرتبط بشكل منفصل وإضافتها إلى العدد الموجود في الجزء المرتبط. على سبيل المثال، في الجزء غير المرتبط من خلايا فأر مُحصن ممثل، كان العدد الإجمالي للخلايا التائية الموجبة لـ CD four والنوعية للإبيتوب 8.97 × 10³.وبالتالي، من خلال جمع الأعداد في الكسرين المرتبط وغير المرتبط، كان هناك 2.43 × 10⁴ من إجمالي الخلايا التائية CD4 الموجبة والمحددة للإبيتوب في عينة الفأر الملقح بأكملها. وبالفعل، إذا كان تمدد الخلايا المحددة للإبيتوب قوياً بما يكفي، يمكن تخطي عملية الإثراء. وبعد إجراء عملية الإثراء، يمكن تنفيذ خطوات التثبيت الذاتي والنفاذية لتمكين صبغ البروتينات داخل الخلوية مثل السيتوكينات وعوامل النسخ.بينما صُممت هذه الطريقة في الأصل لدراسات الخلايا التائية T cells من الطحال والعقد الليمفاوية، يمكن تطبيقها أيضاً على أنسجة أخرى مثل الغدة الزعترية والأمعاء. كما يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة الخلايا التائية T cells المتخصصة في النمط الظاهري epitype في عينات الدم والأنسجة البشرية.

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

هذا الإجراء يدل على تنقية والتوسع في المختبر من خلايا CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية من الدم المحيطي كله والتصور وذلك باستخدام MHC tetramers الطبقة الثانية Tetramers تسمح التصور المباشر للخلايا T مع خصوصية واحدة ومحددة مستضد MHC تقييد الدرجة الثانية.

المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers

يصف هذا الفيديو بروتوكولا لعزل خلايا CD8 + T النادرة الخاصة بالمستضد باستخدام الخلايا العارضة للمستضد الاصطناعي القائمة على الجسيمات النانوية المغناطيسية (aAPCs) التي تعمل مع معقد التوافق النسيجي الكبير المحمل بالمستضد والأجسام المضادة ل CD28. يؤدي تفاعل aAPCs مع خلايا CD8 + T التي تعبر على وجه التحديد عن مستقبلات الخلايا التائية التي تستهدف الببتيد المستضد ، متبوعا بتوسعها في المختبر ، إلى تخصيب وتوسيع مجموعة الخلايا التائية CD8 +.

التخصيب القائم على الجسيمات النانوية وتوسيع الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد

يوضح هذا الفيديو طريقة لتوصيف الخلايا التائية الذاكرة CD8 + الخاصة بفيروس نقص المناعة السيمياني (SIV) باستخدام رباعيات التوافق النسيجي المركب من الفئة الأولى (pMHC-I). رباعي pMHC-I عبارة عن مركب من أربعة جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير - I مرتبطة بالببتيدات الخاصة ب SIV ومترافقة مع الفلوروفور. ترتبط هذه الرباعيات بشكل انتقائي بمستقبلات الخلايا التائية (TCRs) على خلايا CD8 + T الخاصة ب SIV ، مما يسهل توصيف هذه الخلايا.

تقنية تلطيخ Tetramer الببتيد-MHC-I لتحليل خلايا ذاكرة CD8+ الخاصة ب SIV

يمكن فحوصات البيوكيميائية مع المؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم سريع، رؤى الكمي في تحديد حاتمة المناعية، الحذف، أو التصميم. هنا، يوصف مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II تحجيم لوحات 384 جيدا. هذا الشكل فعالة من حيث التكلفة يجب أن تكون مفيدة في مجالات deimmunization البروتين وتصميم لقاح والتنمية.

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

تصف هذه المخطوطة كيفية إجراء فحوصات قائمة على نقل طاقة الرنين Förster (FRET) (جزيء واحد) لقياس ديناميكيات الارتباط بين مستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCR) وجزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير المحملة بالمستضد الببتيد عند حدوثها داخل المشبك المناعي لخلية T على اتصال بطبقة ثنائية دهنية مدعومة بمستو وظيفي.

قياس TCR-PMHC التجليد<em&gt; في الموقع</em&gt; باستخدام الميكروسكوب الفحص القائم على الحنق

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل للتعداد وتميز المكاك ريسوس خلايا CD8 + T ضد فيروس الإيدز. هذه المقالة هي مفيدة ليس فقط في مجال علم المناعة فيروس نقص المناعة البشرية، ولكن أيضا في مناطق أخرى من البحوث الطبية الحيوية حيث من المعروف أن استجابة خلايا CD8 + T للتأثير على نتائج المرض.

تحليل قردي نقص المناعة CD8 للفيروسات محددة + خلايا تي في القرد قرود المكاك التي كتبها الببتيد-MHC-I Tetramer تلطيخ

وهنا يصف لنا أسلوب الذي يجمع في الموقع تيترامير MHC تلطيخ مع إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد الترجمة، والنمط الظاهري، وكمية محددة مستضد الخلايا في الأنسجة. هذا البروتوكول يستخدم لتحديد الخصائص المكانية والمظهرية لخلايا تي CD8 مستضد على حدة بالنسبة لنوع الخلية الأخرى والهياكل في الأنسجة.

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

محددة مستضد خلايا تي من الصعب أن تميز أو تستخدم في العلاج بسبب هذه الغاية منخفضة التردد. هنا، نحن نقدم بروتوكول لتطوير جسيمات مغناطيسية التي يمكن ربط محددة مستضد خلايا تي لإثراء هذه الخلايا ومن ثم توسيعها عدة عف لتوصيف والعلاج على حد سواء.

إثراء وتوسيع نطاق خلايا نادرة محددة مستضد تي مع جسيمات نانوية مغناطيسية

نقدم هنا، على بروتوكول للسابقين فيفو الكشف النوعي من CD8 محددة مستضد+ تي الخلايا. من الممكن تحليل مع تعليق خلية واحدة فقط من الأجهزة أو من كميات صغيرة من الدم. تتطلب مجموعة واسعة من الدراسات تحليل استجابات الخلية cytotoxic T (التطعيم ودراسات السرطان العلاج المناعي).

الكمي المتزامن ل CD8 لمكافحة ناقلات الأمراض والتحوير-الخاصة بمكافحة+ تي الخلايا عن طريق MHC أنا تيترامير تلطيخ بعد التطعيم مع ناقل فيروسي

هنا ، نقدم بروتوكولا لتنقية مجمعات الببتيد من الفئة الأولى والثانية من MHC من خطوط الفئران والخلايا البشرية التي توفر بيانات عالية الجودة عن الببتيدوميكا المناعية. ويركز البروتوكول على تحضير العينات باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا.

الببتيدات المناعية: عزل الفأر والببتيدات البشرية المرتبطة بالفئران MHC من الفئتين الأولى والثانية لتحليل الطيف الكتلي

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتحديد مجموعات الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد في رئتي الفئران من خلال إثراء الخلايا التائية القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: رباعيات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC).

تحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد من رئتي الفأر مع الببتيد: رباعيات التوافق النسيجي المعقدة الرئيسية

تعلم عزل خلايا T النادرة المحددة للإبيتوب باستخدام رباعي الببتيد:MHC والخرز المغناطيسي من خلايا لمفاوية فأرية. تُحسّن هذه الطريقة فهم الاستجابات المناعية الطبيعية.

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

استكشف المزيد من الفيديوهات