البصرية محاصرة من الجسيمات النانوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء إعداد للاحتجاز البصري بفتحة صغرى لاحتجاز جسيمات يبلغ حجمها حوالي 20 نانومتر. ولتحقيق ذلك، يتم إضافة كاشف إلى إعداد احتجاز بصري بالليزر موجود مسبقاً لتمكين عملية القياس. بعد ذلك، يتم توزيع محلول الجسيمات النانوية المراد قياسه في غرفة مائعية دقيقة تحتوي على مصيدة ثنائية الثقوب النانوية، ثم يتم تحميل الغرفة على إعداد الاحتجاز البصري.

عندما تدخل جسيمة إلى الفتحة المضاءة، يزداد نفاذ الضوء بشكل كبير بسبب التحميل العازل كهربائيًا. وإذا حاولت الجسيمة مغادرة الفتحة، فإن انخفاض النفاذ يؤدي إلى تغيير في الزخم نحو الخارج من الثقب، ووفقًا لقانون نيوتن الثالث، ينتج عن ذلك قوة تسحب الجسيمة مرة أخرى إلى داخل الثقب مما يؤدي إلى حبسها. وتسبب الجسيمة إزاحة حمراء لمنحنى النفاذ، وهو ما يمكن مراقبته.

وبذلك، يمكن أن يصبح المصيدة بمثابة مستشعر. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر أحداث احتجاز الجسيمات النانوية، بما في ذلك تفكك البروتينات المحتجزة، كما يتضح من التغيرات في شدة الليزر عبر الثقب النانوي المزدوج. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الاحتجاز البصري بقوة التدرج، في قدرتها على احتجاز جسيمات نانوية أصغر بشدات ليزر أقل.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في الكيمياء الحيوية، مثل كيفية طي البروتينات المفردة وتفاعلها، وكيفية إصابة الجسيمات الفيروسية للخلايا الحية؟ وبشكل عام، قد يواجه الأفراد صعوبة في تطبيق هذه الطريقة نظراً لصعوبة دمج الثقب النانوي المزدوج في نظام احتجاز ليزري قائم. يعتمد إعداد الاحتجاز البصري على مجموعة ملقط بصري من Thor Lab، مجهزة بوحدة قياس القوة.

يُستخدم الثنائي الضوئي الانهياري لاستبدال كاشف الربع في وحدة قياس القوة. عند إعداد نظام الاحتجاز البصري، يجب ارتداء واقي العينين في كل مرة يكون فيها الليزر قيد التشغيل. تأكد من احتواء الشعاع ضمن منطقة آمنة من خلال العمل في غرفة مغلقة وحصر الشعاع داخل إعداد الاحتجاز قدر الإمكان، كما يجب تجنب ارتداء المجوهرات العاكسة.

يتم ارتداء قفازات اللاتكس. لضمان نظافة التجهيزات البصرية، قم بإعداد مجموعة الملاقط الضوئية ووحدة قياس القوة. وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، تتميز مجموعة الملاقط الضوئية المجمعة بتصميم مجهر ضوئي مقلوب وتتكون مما يلي: ليزر حصر، وعدسة شيئية غمر زيتي بقوة 100x، ومنصة تحديد مواقع العينة ثلاثية المحاور، وكاميرا CCD.

يرجى ملاحظة أن الحماية من التفريغ الإلكتروستاتيكي مستحبة عند التعامل مع صمامات الليزر الثنائية (laser diodes). تتيح وحدة قياس القوة معايرة الملاقط الضوئية باستخدام الكشف الموضعي للمستوى البؤري الخلفي للمكثف. ويُستخدم صمام ثنائي ضوئي انهياري (avalanche photo DDE) قائم على السيليكون أو كاشف ضوئي (PD) بدلاً من وحدات قياس القوة.

قم بتركيب مرشح مقاومة ومكثف أو مرشح RC لكاشف موضع الربع باستخدام مقاومة بقيمة 200 kilo ohm ومكثف بقيمة 100 picofarad. يُستخدم هذا المرشح لتقليل ضوضاء الترددات العالية وتسهيل رصد أحداث الاحتجاز على راسم الإشارات. استخدم كابلًا محوريًا لتوصيل مرشح RC بعد كاشف الـ A PD. ثم استخدم كابلات محورية ومحول T لتوصيل راسم الإشارات ووحدة الحصول على البيانات بمرشح RC.

النظام الآن جاهز لتحميل العينة. تتكون فتحة الثقب النانوي المزدوج من ثقبين نانويين تم حفرهما في غشاء ذهبي بواسطة حزمة أيونية مركزة. يبلغ سمك الغشاء 100 nanometers وهو مدعوم بركيزة زجاجية.

تتداخل الثقوب النانوية لإنتاج نتوئين حادين. وسيتم احتجاز الجسيمات النانوية في الفجوة الموجودة بين هذين النتوئين بواسطة ضوء الليزر، والذي يسقط على الثقب النانوي المزدوج.

يجب أيضاً حفر علامات تسجيل كبيرة في الغشاء المعدني للمساعدة في تحديد موقع الثقب النانوي المزدوج تحت المجهر الضوئي. يجب وضع هذه العلامات على بُعد حوالي 100 microns من الثقب النانوي المزدوج. صُب 10 grams من قاعدة poly dimethyl suboxane أو PDMS وجرام واحد من عامل المعالجة في كوب مخصص للاستخدام مرة واحدة، ثم اخلطهما لبضع دقائق.

ثم قم بتفريغ الخليط في غرفة مفرغة من الهواء حتى تختفي جميع الفقاعات. بعد ذلك، صب 1.5 grams من PDMS في طبق بتري بقطر تسعة سنتيمتر. قم بطلاء PDMS بالتدوير على قاع طبق بتري بسرعة 950 RPM لمدة 65 seconds بعد بدء الدوران.

لا يُعد السُمك أمراً حرجاً طالما أنه أقل من 80 microns. ضع برفق من ثلاث إلى خمس غطاءات مجهرية (cover slips) من الرقم 1.5 فوق الـ PDMS بحيث لا تتداخل، ثم قم بالتفريغ لمدة 30 دقيقة.

إذا تحركت الغطاءات الزجاجية وانزلقت وتراكمت فوق بعضها البعض أثناء عملية التخلخل، فقم بتحريكها عن بعضها برفق. تأكد من الحفاظ على طبقة PDMS تحت الغطاءات الزجاجية رقيقة ومنتظمة. ثم قم بتخلخل طبق بتري مرة أخرى لمدة 30 دقيقة.

أخرج طبق بتري من غرفة التفريغ وسخنه على لوح تسخين لمدة 20 دقيقة عند 85 درجة مئوية لمعالجة الـ PDMS. وبمجرد تصلب الـ PDMS، استخدم شفرة حلاقة للقص على طول حواف إحدى شرائح التغطية. ثم استخدم ملقطاً دقيق الرأس أو شفرة لرفع الشريحة برفق، حيث ستلتصق طبقة رقيقة من الـ PDMS بشريحة التغطية.

ضع شريحة الغطاء مع PDMS في طبق بتري جديد. ثم باستخدام شفرة حلاقة، قم بقص نافذة بمقاس 3 مم في 3 مم في الـ PDMS. ستشكل هذه النافذة الغرفة التي سيتم فيها وضع محلول الجسيمات النانوية.

استخدم قاطع ليزر لتصنيع حامل شرائح مجهرية من الأكريليك يحتوي على ثقب بقطر ثلاثة أرباع البوصة في المركز. قم بتغطية محيط الثقب بشريط لاصق مزدوج الوجه. استخدم شفرة حلاقة لإزالة أي جزء زائد من الشريط اللاصق.

ضع شريحة المجهر المُصنّعة فوق إحدى أغطية الشرائح المطلية بـ PDMS والمجهزة مسبقاً، بحيث يكون الـ PDMS محصوراً بين الزجاج والأكريليك. وباستخدام ماصة دقيقة، أضف بضع قطرات من محلول كرات البوليسترين النانوية بتركيز 0.05%weight per volume إلى نافذة الـ PDMS.

أضف قطرة واحدة على الغشاء الذهبي حيث تقع الثقوب النانوية. ضع العينة الذهبية فوق شرائح التغطية بحيث تكون الثقوب النانوية داخل نافذة PDMS. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل الحجرة.

بعد ذلك، اضغط العينة الذهبية مقابل الغطاء. قم بمسح وتجفيف أي محلول زائد نظراً لاستخدام عدسة شيئية غمر زيتية. أضف قطرة من الزيت على الجانب الآخر من غطاء الشريحة فوق نافذة PDMS.

لاحظ موقع الثقوب النانوية. أدخل الشريحة في حامل الشرائح بحيث يكون الزيت متجهًا للأسفل، ثم اخفض حامل الشرائح حتى يلامس زيت الغمر المجهر.

قم بمحاذاة منصة الشريحة تقريبياً بحيث تكون علامات التسجيل المحفورة في غشاء الذهب تحت الشيئية. وباستخدام برنامج الحصول على الصور مثل Thor site، المضمن كجزء من مجموعة الاحتجاز، حدد علامات التسجيل الموجودة على غشاء الذهب واتبع خطوط المؤشر وصولاً إلى الثقوب النانوية.

قم بوضع الشريحة بحيث يتم إبعاد علامات المؤشر والمناطق المفتوحة الأخرى عن مركز الشاشة. قد يؤدي النفاذ المفرط للضوء إلى تلف الـ A PD، لذا قم بتشغيل الليزر. ونظراً لأن المرآة ثنائية اللون ليست مثالية، فمن المفترض أن تظهر بقعة ناتجة عن شعاع الليزر بالقرب من مركز الشاشة.

باستخدام برنامج التحكم في المنصة البيزوكهربائية (pizo stage)، يتم تحسين المحاذاة بدقة أكبر على المحاور الثلاثة كافة. وعندما تكون المحاذاة صحيحة، سيتم رصد أقصى جهد لـ PD، مما يشير إلى أعلى مستوى نفاذ عبر الفتحة النانوية.

الآن وبعد إعداد النظام وتحميل العينة، يمكن البدء في الحصول على بيانات الاحتجاز البصري. بمساعدة علامات المؤشر، قم بوضع البقعة بالقرب من موقع ثقب نانوي معروف. ستكون الثقوب النانوية المزدوجة صغيرة جداً لدرجة تمنع تحليلها بوضوح، وستظهر كنقاط صغيرة على الشاشة.

يُشار إلى نفاذ الضوء عبر العينة من خلال مستوى الإشارة على oscilloscope. قم بمحاذاة العينة بشكل إضافي لزيادة نفاذ الضوء إلى أقصى حد. انتبه لعلامات المؤشر والخدوش المرئية وغير المرئية، حيث سيكون نفاذ الضوء مرتفعاً في هذه المناطق، بينما ستظهر الثقوب النانوية (nano holes) قفزات مفاجئة في نفاذ الضوء مقارنة بالخدوش.

أظهر تغييرات أكثر تدريجياً باستخدام لوحة الموجة. اضبط استقطاب الضوء لتحقيق أعلى نفاذية للضوء نظراً لأن هيكل الثقوب النانوية المزدوجة مستقطب. وللحصول على البيانات، قم بأخذ عينات من جهد APDs باستخدام وحدة الحصول على البيانات للفترة الزمنية المطلوبة.

تكون أوقات الاستحواذ عادةً في حدود مئات الثواني. وفي هذه الحالة، يتم استخدام برنامج مخصص لاستحواذ البيانات ويتم أخذ عينات الجهد بمعدل 2000 مرة في الثانية. وباستخدام MATLAB، قم بتصفية البيانات المستحوذ عليها باستخدام مرشح KY Gole ورسمها مقابل الزمن على رسم بياني لإظهار احتجاز جسيمات polystyrene النانوية بحجم 20 nanometer، حيث تم قياس النفاذية عبر الثقب النانوي المزدوج كدالة في الزمن.

استُخدم كاشف ضوئي (PD) لرسم مخطط النفاذية الضوئية. وبمرور الوقت، يتسم حدث الاحتجاز بكونه مفاجئاً وبحافة حادة تُظهر تحولاً واضحاً بين مستويين من قدرة النفاذية كما هو موضح في هذا المثال، وغالباً ما تحدث زيادة في ضوضاء الإشارة في حالة الاحتجاز. وتنتج هذه الزيادة في الضوضاء عن الحركة البراونية للجسيم المحتجز.

لاحظ أن مصدر الضوضاء هذا لا يتواجد في حالة عدم وجود جسيم محتجز. قد تظهر بعض الشوائب في النتائج التي لا تشير إلى أحداث الاحتجاز. يجب استبعاد النتائج التي تظهر انجرافاً يتمثل في تغيرات بطيئة في الإرسال على مدى فترة زمنية مدتها عدة دقائق كما هو موضح هنا. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل مطيافية رامان والمطيافية الفلورية للإجابة على أسئلة إضافية حول طبيعة الجسيم النانوي المحتجز بعد تطويره.

لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة الجسيمات النانوية ذات الصلة بيولوجياً على مستوى الجزيء الواحد؛ فعلى سبيل المثال، يمكن استخدامها لاستشعار ارتباط البروتينات ودراسة العدوى الفيروسية على مستوى الجزيء الواحد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دمج مصيدة بصرية ثنائية من نوع nho في نظام مجهر مقلوب مزود بليزر T لاحتجاز الجسيمات النانوية المنفردة.