Microgavage من يرقات اسماك الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعطاء المواد عن طريق الفم إلى تجويف الأمعاء في يرقات zebrafish. أولاً، يتم تخدير اليرقات ووضعها على قالب حقن مبطن بمادة ميثيل السليلوز. بعد ذلك، يتم غمر اليرقات برفق في القالب ومحاذاتها مع زاوية إبرة التغذية القسرية والمناور الدقيق.

يتم بعد ذلك إدخال الإبرة في فم اليرقة وتوجيهها إلى البصلة المعوية. وبمجرد استقرارها في مكانها، تُفرغ المادة داخل اللمعة. وتتمثل الخطوة الأخيرة في إخراج اليرقة من مادة ميثيل السليلوز ووضعها في وسط غذائي جديد للتعافي من التخدير.

وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه الطريقة لإيصال المواد خصيصاً إلى التجويف المعوي ليرقات zebrafish، حيث يمكن دراسة النقل داخل الأمعاء أو في الأنسجة خارج المعوية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الغمر في الماء الذي يحتوي على المادة المراد دراستها، في إمكانية التحكم بدقة في كمية المادة التي يتم إيصالها إلى الحيوان، بالإضافة إلى توقيت وجرعة الإعطاء. وهذا يقلل من التباين التجريبي، وفي بعض الحالات، يقلل من السمية المرتبطة بمواد معينة.

جاءت فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما واجهنا صعوبة في تطبيق بعض المجسات الفلورية بتركيزات عالية بما يكفي لتكون قابلة للكشف في الظهارة المعوية باستخدام المجهر. فالتراكيز العالية قد تؤدي أحياناً إلى موت الأسماك، ومع ذلك لا تعطي إشارة فلورية كافية للتصوير. للبدء، قم بسحب عدة إبر للتغذية القسرية (gavage needles) باستخدام ساحب الماصات الدقيقة (micro pipette puller) واستعر شعيرات زجاجية من السيليكا.

انتقل إلى مجهر ستيريو لقص الإبر. أولاً، قم بمحاذاة طرف الإبرة مع نهاية مسطرة شفافة أو ورق رسم بياني. وبمجرد المحاذاة، استخدم ملاقط ساعات دقيقة الطرف لقص الإبرة على بُعد حوالي واحد مليمتر من الطرف.

افحص طرف الإبرة عند تكبير 100 مرة. يجب أن يكون قطر الإبرة حوالي 27 إلى 30 microns وأن تكون ثلمة. ينبغي تجنب الإبر الحادة أو المسننة لضمان الحصول على نتائج أكثر اتساقاً.

يمكن استخدام فرن صهر دقيق (micro forge) لتحكم أفضل في نقطة قص الإبرة وتلميعها بالنار. قم بإزالة الحواف الحادة. بعد ذلك، قم بتحضير محلول التغذية القسرية (gavage solution).

في معظم التطبيقات، يُضاف الفينول الأحمر للمساعدة في رؤية المحقن الدقيق وتحديد موضع محلول التغذية القسرية. بعد التعبئة بالزيت المعدني، قم بتركيب إبرة التغذية القسرية على وحدة الحقن الدقيق nano jet two. قم بتغطية طبق بتري بلاستيكي بقطر 10 سنتيمتر بغشاء حيوي (biofilm) لتوفير سطح مستوٍ ومقاوم للماء، ثم ضع كمية مقدارها 2 µL تقريبًا من محلول التغذية القسرية فوق فيلم البارافين.

تتمثل الخطوة التالية في ملء إبرة التغذية القسرية يدوياً. يجب توخي الحذر لتجنب إدخال فقاعات هواء في الزيت المعدني. ولمعايرة حجم القذف، يتم حقن قطرات صغيرة في طبق بتري صغير مملوء بالزيت المعدني حتى تصبح متسقة في الحجم، ثم يتم قياس قطر القطرات باستخدام الرسم البياني لحساب حجم القطرة.

يتم هنا رسم الاتساق بين الإبر. قبل استخدام الإبرة للتغذية القسرية، أزل أي بقايا من الزيت المعدني عن طريق الشطف في وسط نظيف لسمك الزيبرا. بعد تدفئة قالب Aros، غطِ ثلاثة أخاديد باستخدام 3% ميثيل السليلوز. يجب تغطية الأخدود بما يكفي فقط لتثبيت السمكة، ولكن ليس بكمية قليلة تؤدي إلى جفاف ميثيل السليلوز بسرعة.

بعد ذلك، يتم توزيع حوالي 4 mL من وسط zebrafish في آبار طبق سداسي الآبار، ثم تُنقل يرقات zebrafish الخاصة بكل مجموعة تجريبية إلى آبار منفصلة. ولتخدير الأسماك، يتم تحضير محلول tricaine بتركيز 3-fold في وسط zebrafish المناسب في كل بئر.

قم بتخدير الأسماك عن طريق خلط حجم مساوٍ من محلول trica في الوسط والتحريك بلطف. وبمجرد توقف الأسماك عن الحركة، استخدم ماصة بستير ذات فتحة واسعة لنقلها واحدة تلو الأخرى إلى مادة ميثيل السليلوز، بحيث تكون رؤوسها عند زاوية 45 درجة من الأخدود وذيولها ممتدة نحو زاوية 90 درجة من الأخدود. استخدم مسبار تشريح غير مدبب للضغط بلطف على كل سمكة في ميثيل السليلوز لتثبيت وضعيتها.

بعد ذلك، اضبط جهاز الحقن المجهري nano jet two بحيث تكون الإبرة مائلة بزاوية ضحلة. تأكد من أن نطاق التمديد سيكون كافياً للوصول إلى ما بعد قاع البئر. وللحد من الحاجة إلى تعديلات مستقبلية، اضبط وحدة الحقن المجهري لإطلاق 4.6 nanoliters باستخدام إعداد الحقن البطيء، مع وضع يد واحدة لإجراء تعديلات طفيفة على الطبق الذي يحتوي على اليرقات المثبتة واليد الأخرى للتحكم في الملاعب المجهري لوحدة الحقن المجهري.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن أسماك zebra fish صغيرة جداً وسهلة الإصابة. يتطلب الأمر تدريباً لتحديد بنية المريء تحت المجهر المجسم (stereo microscope) وتحديد مقدار الضغط المناسب الذي يجب تطبيقه على إبرة التغذية الأنبوبية (gavage needle) للوصول إلى تجويف الأمعاء. أولاً، قم بتوجيه إبرة التغذية الأنبوبية برفق إلى فم سمكة مخدرة.

مرر المادة عبر المريء واضغط قليلاً على المصرة المريئية لإدخال الطرف للداخل قليلاً من الجدار المعوي الأمامي. وبمجرد الوصول إلى داخل البصلة الأمامية، قم بإعطاء المادة بلطف وفق هذه الإعدادات. يجب أن يملأ الحجم المُوصَّل البصلة الأمامية للأمعاء فقط، دون أن يتسرب خارج المريء أو المذرق.

اسحب الإبرة بسرعة وسلاسة. احرص على عدم إطلاق كميات كبيرة من المادة في المريء. بعد إزالة إبرة التغذية القسرية، انقل السمكة إلى طبق يحتوي على وسط غذائي طازج.

أيقظ اليرقات من التخدير وأزل مادة ميثيل السليلوز عن طريق شطفها في وسط غذائي جديد عدة مرات. انقل اليرقات إلى طبق بتري أو لوحة ذات ستة آبار حتى وقت الحاجة إليها. ولإجراء التحاليل اللاحقة، يمكن استخدام التغذية القسرية الدقيقة (micro gavage) لإيصال مواد متنوعة إلى سمك الزيبرا المستخدم في الاختبار.

للبدء، قم بتحضير محاليل التغذية القسرية (gavage) اللازمة لتقديم عرض توضيحي لهذه الطريقة. يُستخدم الـ 10 KD dextran المقترن بـ Texas Red لتحليل سلامة الحاجز في الظهارة المعوية.

باتباع الخطوات الموضحة سابقاً، قم بإجراء التغذية القسرية لمجموعات تتراوح بين 10 إلى 20 يرقة من أسماك الزيبرتيش لكل حالة تجريبية. كرر هذه العملية على مجموعات مزدوجة أو ثلاثية إن أمكن. بعد التغذية القسرية، استعد اليرقات من التخدير واتركها تسبح بحرية في وسط غذائي جديد.

بعد مرور 20 دقيقة تقريبًا، أعد تخدير اليرقات كما تم توضيحه سابقًا. وبمجرد تخديرها، ثبّت اليرقات في ميثيل السليلوز بتركيز 3% فوق كتلة أغاروز بتركيز 3%. صوّر اليرقات باستخدام مجهر ستيريو فلوري وفلتر Texas red، مع اختيار تكبير يظهر اليرقة من الخطم وصولاً إلى ما بعد نهاية المذرق مباشرة. يجب أن يكون التألق الفلوري شديدًا في لمعة الأمعاء.

ومع ذلك، يتم تقييم وظيفة الحاجز من خلال مستوى الديكستران الذي يظهر في الأنسجة خارج المعوية، مع ضبط التعريض لتمكين رؤية الفلورة في الجذع. وحتى لو أدى ذلك إلى تعريض مفرط للفلورة اللمعية عند إعطائه بمفرده، فإن الديكستران يتم الاحتفاظ به داخل لمعة الأمعاء. ومع ذلك، في اليرقات التي عولجت بـ EDTA، والذي يعمل على تفكيك الوصلات المحكمة الظهارية، يظهر الديكستران في الدورة الدموية والأوعية والفراغات تحت المخاطية.

في هذه الأمثلة، تم استخدام برنامج Image J لقياس متوسط الفلورة النسبية في منطقة اهتمام في جذع سمكة الزيبرا، وتم تطبيعها بالنسبة لمنطقة اهتمام خارج السمكة كعنصر تحكم داخلي. هنا، تمت مقارنة النتائج المستمدة من إبرة عادية بتلك المستمدة من إبرة micro forge. أظهر عدد أقل من اليرقات في مجموعة الدكسترين وحدها فلورة خارج الأمعاء، مما يشير إلى أن إبر micro forge أقل عرضة للتسبب في إلحاق الضرر باليرقات.

عند النظر إلى منطقة واحدة عن كثب، يتبين مجدداً أن الديكستران يظل محصوراً في التجويف المعوي دون أن يتسرب إلى الأوعية الدموية أو المساحات خارج المعوية. وفي غياب EDTA، وعندما يتم حقن الديكستران بالتزامن مع EDTA، يُلاحظ وجود الديكستران في المساحات خارج المعوية وداخل تجويف الأبهر الظهري والوريد الكاردينالي الخلفي، وتعود إشارة الدم هنا إلى تدفق الدم. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، تأكد من أن الإبرة لا تحتوي على حواف مسننة، وأن الأسماك مثبتة جيداً ومؤمنة في مادة Methylcellulose، وكن حذراً وصبوراً أثناء تعلم كيفية توجيه الإبرة عبر مريء اليرقة.

يمكن استخدام هذه التقنية في مجموعة واسعة من التطبيقات في سمكة الزيبرا التي تتطلب إدخالاً محكوماً أو تصويراً للمواد داخل الأمعاء. فهي تتيح تحكماً دقيقاً في توقيت ومسار وجرعة الإيصال إلى الحيوان، مما يقلل بشكل كبير من التباين داخل التجربة الواحدة وبين التجارب المختلفة.