عبر الجسم الحي فرط الحساسية النوع المتأخر الفحص ل Antigen تنظيم محدد

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام اختبار DTH عبر الجسم الحي لمراقبة الاستجابات المحددة للمستضد المؤيد والمضاد للالتهابات في البشر. أولا ، عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة من الدم المحيطي للإنسان. ثم امزج تحضير PBMC مع PBS.

استدعاء مستضد اختبار المستضد واختبار المستضد بالإضافة إلى استدعاء المستضد. استمر في قياسات وسادة القدم وحقن الخلائط المحضرة في الفئران الانزلاقية. تكرر وسادات القدم القياسات بعد 24 ساعة. تلاتة.

الأنماط النهائية لاستجابات DTH هي تنظيمية محتملة وغير تنظيمية وحساسة. يمكن تطبيق مقايسة فرط الحساسية من النوع المتأخر عبر الجسم الحي لتحديد المعلمات السريرية مثل استجابات تفاعل allo حيث يكون مصدر المستضد هو خلايا المتبرع بالزرع. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الموجودة في المختبر هي أنه يمكن للمرء بسهولة اكتشاف الاستجابات المؤيدة للالتهابات والتنظيمية لمستضدات allo أو المستضدات الذاتية أو مستضدات الورم باستخدام نظام فحص واحد.

إيجون ، وهو باحث في مختبري الآن الإجراء باستخدام الدم المحيطي البشري الطازج الذي تم جمعه في أنابيب سكر العنب الحمضية سيترات لتجنب تنشيط الصفائح الدموية. عزل PBMC باستخدام وسط فصل الخلايا الليمفاوية وفقا للطرق القياسية. اغسل مستحضر PBMC باستخدام PBS لإزالة الصفائح الدموية الملوثة.

إذا كان هناك تلوث ملحوظ لخلايا الدم الحمراء ، فقم بإجراء تحلل الخلايا الحمراء باستخدام محلول تحلل CK. ثم قم بإجراء غسلتين أخريين باستخدام PBS Resus. قم بتعليق PBMC في PBS بتركيز 10 ملايين PBMC لكل مليلتر لمستضد allo.

ابدأ ب P BMCs ، معزولة عن الدم المحيطي للمتبرع باستخدام الإجراء الموضح سابقا. ثم resus. قم بتعليق الخلايا المانحة في PBS بتركيز 120 مليون خلية لكل مليلتر وأضف ميكرومولار واحد من PMSF لمنع تدهور البروتين.

الآن صوتنة تعليق الخلية باستخدام سبع نبضات ثانية واحدة مع مسبار اثنين ملليمتر. باستخدام مقياس الخلوي الدموي. تحقق من تعطيل أكثر من 90٪ من الخلايا.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 14 ، 000 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوبين آمنين وحدد تركيز البروتين بالطرق القياسية لكل حقنة. Aliquot سبعة في 10 إلى سادس P BMCs إلى ملليلترين.

أنابيب القفل الآمنة بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أولا ، قم بإعداد تعليق التحكم السلبي ل PBMC في 35 ميكرولتر من PBS. ثم للتحكم الإيجابي ، أضف 25 ميكرولترا من مستضد الاستدعاء ، والكزاز ، والسموم ، والثنائي ، والسموم ، واضبط حجم الحقن على 35 ميكرولتر باستخدام PBS.

وفقا للتصميم التجريبي لتقييم الاستجابة المحددة للمتبرع ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 ميكرولتر من مستضد المتبرع بالإضافة إلى 25 ميكرولترا من PBS لحجم إجمالي يبلغ 35 ميكرولترا. لتقييم التنظيم الخاص بمستضد المتبرع التجريبي ، يقوم resus بتعليق حبيبات الخلية في 35 ميكرولتر عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من مستضد المتبرع و 25 ميكرولترا من مستضد TT DT الاستدعاء. بعد التخدير ، يضع الماوس الانزلاقي مع الفلور الفرجار المحمل بنابض في وسط وسادة القدم مع حافة واحدة تلامس وسادة المشي الأخيرة للقدم لتوفير معيار للحفاظ على اتساق موقع القياس عند استقرار قراءة المقياس.

سجل سمك وسادة القدم الأساسية لحقن وسادة القدم. ضع المحقنة مع توجيه الإبرة نحو أصابع القدم والشطبة متجهة لأعلى. ابدأ الآن الحقن تحت الجلد لكل تعليق خلية في وسادات القدم الخلفية للماوس.

رقم واحد ، قم بحقن وسادة القدم اليمنى ببطء مع إعداد التحكم السلبي. بعد ذلك ، قم بحقن وسادة القدم اليسرى بالتحكم الإيجابي في PBMC بالإضافة إلى TT dt. الآن أعد الماوس إلى قفصه للماوس.

ثانيا ، قم بحقن وسادة القدم اليمنى بمستضد PBMC plus allo ووسادة القدم اليسرى مع PBMC plus allo antigen plus TT dt. تأكد من عدم وجود تسرب بعد حوالي 18 إلى 24 ساعة من الحقن. قم بتخدير كل فأر باستخدام الفلور وكرر قياس تورم وسادة القدم.

اطرح سمك كل وسادة قدم قبل الحقن من قيمة ما بعد الحقن للحصول على قيمة تورم وسادة القدم. ثم احسب صافي التورم الخاص بالمستضد عن طريق طرح قيمة تورم وسادة القدم للتحكم من قيم تورم وسادة القدم التي تم الحصول عليها من العلاجات. تحقق من قراءة التحكم الإيجابي استجابة تحكم إيجابية لاستدعاء المستضد TT DT أكبر من أو يساوي 25 في 10 إلى سالب أربع بوصات.

استجابة خلفية ل PBS حتى يعتبر الاختبار صالحا. بعد ذلك ، حدد تثبيط استجابات الاستدعاء في وجود مستضدات مانحة. تقوم هذه التجربة بتقييم متلقي زراعة الكلى من أجل الاستجابة الخاصة بمستضد المتبرع والتنظيم.

هناك ثلاثة أنماط رئيسية لفرط الحساسية من النوع المتأخر لدى متلقي الزرع ، تنظيمي ، وغير تنظيمي ، وحساس. استجاب جميع المرضى بقوة للتحكم الإيجابي في مستضد الاستدعاء tt. يظهر المريض رقم 62 النمط التنظيمي الذي يتميز باستجابة ضعيفة لمستضد المتبرع وقمع مرتبط ملحوظ لاستدعاء استجابة المستضد في وجود مستضد متبرع.

هذا هو النمط الذي وجد أنه مرتبط بتحمل الطعم الخيفي للأعضاء. يظهر المريض رقم 48 نمطا غير تنظيمي ، والذي يتميز بالاستجابة الضعيفة للمتبرع ، ولكن لا يوجد قمع مرتبط. وقد لوحظ هذا النمط بشكل متكرر في المرضى الذين يتناولون الأدوية المثبطة للمناعة.

المريض رقم ثمانية نمطا حساسا للمتبرع يتميز باستجابة عالية لمستضد المتبرع وعدم وجود قمع مرتبط. ترتبط هذه الاستجابة برفض الكسب غير المشروع. في دراسات الحالة السريرية ، تم فحص P BMCs من الأشخاص المسجلين في تجربة قائمة على الملاحظة للمسار غير المباشر المحدد للمتبرع ، والاستجابات التنظيمية T و T لتقييم دور التنظيم الخاص بالمتبرع في التسامح السريري.

تكشف استجابات التكتور غير المباشرة لمستضدات المتبرعين عن طيف مميز عبر مجموعات التسجيل. يزداد تورم وسادة القدم مع انتقال الحالة السريرية للمريض من تلك التي تتسامح مع تلك التي ترفض بشكل مزمن. هنا ، يقيس اختبار القمع المرتبط المسار غير المباشر المضاد للمتبرع للاستجابة التنظيمية T.

تظهر هذه البيانات انخفاضا في الاستجابات التنظيمية على مدى المدى من المرضى الأكثر تسامحا من خلال المرضى المتوسطين إلى الأقل تحملا الذين يرفضون بشكل مزمن. مجتمعة. يبدو أن تنظيم المناعة كما تم قياسه بواسطة اختبار DTH عبر الجسم الحي هو آلية مهمة لقبول الطعم الخيفي الكلوي.

مجال واعد هو تطبيق اختبار TDTH في مراقبة المناعة الذاتية. كشفت دراستنا لدور الكولاجين من النوع الخامس في العملية المرضية لمتلازمة التهاب القصيبات OBL أن أعلى خطر نسبي لتطور BOS لوحظ في المرضى الذين لديهم استجابة إيجابية للكولاجين. خمسة pbmc من متلقي زراعة الرئة ، ولكن ليس من الضوابط الصحية أو الكولاجين.

أربعة متلازمة المراعي الجيدة التفاعلية كان المرضى بعد زرع الكلى في كثير من الأحيان الكولاجين خمسة التفاعلية. يمكن أيضا استخدام اختبار TDTH لاختبار تفاعل pbmc من مرضى السرطان إلى مستضدات خاصة بالورم. على سبيل المثال ، قد يحد وجود خلايا تنظيمية خاصة ب PAP في مرضى سرطان البروستاتا من الاستجابة للتطعيم بمستضد PAP.

اختبار TRANSVAAL DTH هو اختبار تشخيصي جديد مع تطبيق سريري في تقييم الاستجابات المناعية الخلوية في سرطان الزرع ومرضى المناعة الذاتية. إنه ذو قيمة لأنه ليس مفيدا فقط في مراقبة استجابات استدعاء المستجيب t ، ولكن يمكن استخدامه أيضا للكشف عن الاستجابات التنظيمية T لأنه لا يعتمد على قياس سيتوكين معين للكشف عن التأثير أو الخلايا التائية التنظيمية. إنه مرن للغاية وقابل للتطبيق على نطاق واسع.