إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

تستخدم الطريقة الموضحة في هذا الفيديو خرائط مصير لمرحلة الانقسام لجنين التأليف لتحديد ثقافة بلازر المفردة بمعزل عن بعضها البعض لتقييم ما إذا كانت الكبريتات الجنينية يتم تحديدها من خلال التعليمات الجوهرية أو الخارجية ، يتم جمع أول جنينتين من الخلية حيث يقسم ثلم الانقسام الأول المنطقة المصطبغة قليلا من نصف الكرة الأرضية. يتم زراعة هذه الأجنة عندما تصل الأجنة إلى 16 إلى 32 خلية ، ثم تتم إزالة غشاء vitel ويتم تشريح الخلايا المجاورة بعيدا عن الخلية المختارة. للتوضيح ، يتم بعد ذلك نقل الناسف المفصل إلى اكتئاب في ثقافة مغلفة بالثقاب ، بشكل جيد ومثقف.

بمجرد أن يصل التخطيطي إلى المرحلة المرغوبة ، يتم حصاده لتقييم التعبير الجيني أو البروتيني باستخدام التهجين في الموقع QPCR أو الكيمياء المناعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على غيرها مثل الاستزراع أو مجموعات كبيرة من الخلايا الجنينية أو الأعضاء عند تسجيل الدخول ، هي أن التجديف الجنيني الفردي الذي يعرف مصيره التنموي من دراسات تتبع النسب يمكن استزراعه دون عوامل نمو إضافية أو وجود خلايا مجاورة. وبالتالي ، يمكن للمرء أن يختبر بشكل مباشر ما إذا كانت العوامل الجوهرية في الخلية تطلب من التجديف أن يصبح مقدمة لنسيج معين أو ما إذا كان يتطلب إشارات من الخلايا المحيطة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن تشريح بلير ونقلها إلى آبار الثقافة يتطلب تلاعبا دقيقا تحت المجهر الاستريو. في هذا الفيديو ، سأستخدم هذه الطريقة لتوضيح ما إذا كانت الحمض النووي الريبي المرسال المشتق من الأمهات تميل الخلايا نحو المصير العصبي تعمل تحت مجهر التشريح. شحذ أربع مجموعات من الملقط باستخدام فيلم جلخ Illumina.

زوج واحد من الملقط كنسخة احتياطية في حالة تلف الطرف أثناء الإجراء ، وقم بالتعقيم بالملقط الأربعة وتخزينه في حاوية معقمة لصنع 500 مل لكل من 0.1 × و 1.0 × من محلول ملحي بارث معدل أو MBS وقم بتعقيمها. قم بتخزين هذه المحاليل عند درجة حرارة 14 إلى 18 درجة مئوية لعدة أشهر في زجاجة ذات غطاء لولبي زجاجي ، وقم بإعداد 2٪ من درجة الرحلان الكهربائي في 100 مل من ثقافة X واحدة. الأوتوكلاف المتوسط لإذابة الميكروويف aros ، لتسييل aros عندما تكون هناك حاجة إليها في المرة القادمة عندما يكون aros سائلا.

صب حوالي 0.5 مل في قاع كل بئر من صفيحة ثقافة معقمة 24 بئر. سيمنع ذلك الغرسات من الالتصاق بالبلاستيك. ثم صب حوالي ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر في قاع أطباق بتري من اثنين إلى 360 ملم ولفها برفق لتوزيعها.

ستكون هذه بمثابة أطباق تشريح ويمنع الأروس الأجنة من الالتصاق بالبلاستيك. بمجرد إزالة أغشيتها ، عندما يبرد الهب ويتصلب ، يكون طرف ماصة المراعي بطول ستة بوصات حتى تذوب في كرة. أعد تأطير الكرة لفترة وجيزة ، ثم لمسها برفق على سطح الحروس في بئر من لوحة الثقافة.

سيؤدي ذلك إلى إنشاء اكتئاب ضحل سيتم فيه وضع X explan. كرر لكل بئر في الطبق. بعد ذلك ، املأ كل بئر من لوحة الثقافة بمليلتر واحد من وسط ثقافة معقم واحد.

ثم املأ طبق التشريح ب 0.1 XMBS لتسهيل فصل الناسف. بمجرد تحضير أطباق التشريح ، انقل البيض المخضع مع إزالة معاطف الهلام إلى أطباق بتري مقاس 100 ملم تحتوي على 0.5 × وسط ثقافة. يمكن زراعة تلك التي لا يتم استخدامها على الفور عند 14 درجة مئوية بينما يتم مسح الطبق الأول لجنينتين من الخلية.

قم بمسح الأجنة في طبق بتري الأول باستخدام مجهر التشريح باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، وانقل حوالي 101 خلية وجنينين خليين إلى طبق منفصل مملوء بثقافة 0.5 ×. متوسط. ضع طبق بتري في حاضنة 14 درجة مئوية. تعتمد قدرة هذا الاختبار على تقييم الإمكانات التنموية للخلية بدقة على تشريح التجديف الصحيح بناء على خرائط القدر.

لذلك ، من الأهمية بمكان اختيار الأجنة ذات نمط التصبغ الصحيح في مرحلة الخليتين والتي تتوافق بالتالي مع أنماط الانقسام المنتظمة. كما هو موضح هنا. غالبا ما تحدث الانقسامات المنتظمة على جانب واحد فقط من الجنين.

لا يزال من الممكن استخدام هذه الأجنة كمتبرعين إذا نشأت الخلية المانحة من الجانب العادي. عندما تصل الأجنة إلى مرحلة الخليتين ، قم بفرز تلك التي يقسم فيها ثلم الانقسام الأول المنطقة المصطبغة قليلا في نصف الكرة الأرضية إلى طبق منفصل ، وفرز حوالي خمسة أضعاف عدد الأجنة التي سيتم تشريحها. سيكون هؤلاء هم المانحون للعرض.

احتفظ بجنين الخليتين المتبقيتين في طبق منفصل بجوار الأجنة المانحة طوال الإجراء لتكون بمثابة عناصر تحكم للأشقاء لتنظيم التخطيط. بعد فرز الأجنة وتشريحها ، ارجع إلى الأطباق الموجودة في الحاضنة للعثور على المزيد من أجنة خلية واحدة وخلية واحدة. نظرا لأن أجنة خلية واحدة تستغرق حوالي 90 دقيقة للتقسيم ، يمكن القيام بذلك لمدة تصل إلى ساعتين بعد جمع البويضات.

لتحضير الخطة ، ضع خمسة إلى 10 أجنة في طبق تشريح. ثم ضع الجنين الأول بحيث يمكن الإمساك بالغشاء الشفاف بالملقط. عادة لا يمكن رؤيته ، ولكن يمكن الإمساك به في عمود حيث يتم فصله بمساحة محيطية واضحة فوق سطح الجنين.

باستخدام ملقط حاد بيد واحدة ، أمسك على مسافة من الناسف المراد تشريحه لتجنب إتلافه. ثم باستخدام ملقط حاد ، من ناحية أخرى ، أمسك الغشاء بالقرب من طرف الملقط الآخر واسحب برفق في اتجاهين متعاكسين لتقشير الغشاء بعيدا. سوف يتسطح الجنين عند إزالة الغشاء.

بعد ذلك ، أمسك خلية مجاورة بالملقط واستخدم هذه الخلية كمقبض حتى لا يتم لمس الخلية المراد تشريحها مباشرة بالملقط في اليد الأخرى ، وسحب الخلايا المجاورة المتبقية برفق بعيدا عن التجديف المطلوب. إذا تم استهداف خلايا خط الوسط التي تشترك في نفس المصير ، فيمكن إزالتها معا كزوج. أخيرا ، قم بتشريح خلية المقبض.

التقط التجديف أو زوج الجدف بزجاج معقم بعد الماصة ، وتجنب فقاعات الهواء والشفط المفرط. ضع طرف ماصة المراعي تحت سطح وسط الاستزراع في بئر من طبق الاستزراع X explan، وقم بطرد الناسف برفق. يجب أن تنزلق إلى الاكتئاب الضحل عن طريق الجاذبية.

يمكن دمج التجديف من أكثر من جنين واحد في مخطط واحد عن طريق إيداعهم في نفس الاكتئاب في الثقافة. حسنا ، كرر هذا الإجراء مع الأجنة المتبقية في طبق التشريح واحدا تلو الآخر. بعد حوالي 10 أجنة ، سيتم ملء طبق التشريح بالحطام الخلوي.

عندما يحدث هذا ، قم بالتغيير إلى طبق التشريح التالي. بعد الانتهاء من جميع عمليات التشريح ، تحقق مما إذا كان المسح في المنخفضات الضحلة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيمكن دفعها برفق إلى الاكتئاب باستخدام حلقة شعر تم تعقيمها في 70٪ من الإيثانول وغرسات احتضان المجففة بالهواء في درجة حرارة الغرفة على المقعد بعد حوالي ساعة من التشريح الأخير.

قم بإزالة الحطام المحيط بالخطة الملتئمة باستخدام ماصة المراعي الزجاجية المعقمة. صفيحة explan عند 14 إلى 20 درجة مئوية بجوار طبق بتري الذي يحتوي على أجنة التحكم في الأخوة. ستشير الأجنة الأشقاء إلى مرحلة تطور التجديف.

بعد حوالي ساعة إلى ساعتين في الثقافة ، ستنقسم الأريمات المزروعة حوالي أربع مرات وتزيل معظم الحطام المتبقي من الخلايا المجاورة التالفة. بعد 20 ساعة ، يشكلون كرات صغيرة متينة من الخلايا. عندما يصل الأشقاء إلى مرحلة النمو المرغوبة ، حصاد العرض.

تعيش هذه الخطط بشكل جيد ، حتى لو تفككت بعض الخلايا. لذلك ، إذا كانت هناك كتلة غائمة في الثقافة ، فاستكشفها جيدا باستخدام حلقة شعر أو ملقط لتحديد ما إذا كان المعرض الصحي مدفونا بداخله. التقط المخطط في حجم صغير من محلول الاستزراع بزجاج يتجاوز الماصة وطردها برفق إلى مخزن مؤقت مثبت أو تحلل مناسب للفحص الذي سيتم إجراؤه.

تم تشريح اثنين من التجديف الظهري أو اثنين من التجديف البطني في مرحلة 16 خلية وزرعهما في XMBS واحد عند 14 درجة مئوية حتى وصلت أجنة الأشقاء إلى مراحل الصفيحة العصبية المبكرة. تم فحص كل عينة للتعبير عن صفيحة عصبية زيجوتية. جين سوكس اثنين من خلال التهجين في الموقع ، والذي ينظر إليه على أنه منتج التفاعل الأزرق.

تظهر نتائج هذا الاختبار أن غالبية تجديف الظهرية ، والتي هي سلائف للصفيحة العصبية ، يمكنها التعبير عن SOX اثنين بشكل مستقل. هذا بدون إشارات إضافية من مناطق أخرى من الجنين. قد تكون تلك explan التي لا تعبر عن SOX two قد تم تحديدها بشكل غير صحيح في وقت التشريح.

في المقابل ، لا يعبر أي من تجديف البطنية ، وهي سلائف للبشرة البطنية عن SOX اثنين. تشير هذه البيانات إلى أن تجديف الظهرية لديها قدرة جوهرية على تكوين أنسجة عصبية ، في حين أن تجديف البطنية لا يلاحظون. كما قامت بعض التخطيطات الظهرية بإطالة مورفولوجيا تدل على تكوين الأديم المتوسط الظهري.

تتلاشى هذه الأرومات أيضا لتشكيل نور في الجنين السليم وتعبر ثقافة explan عن بروتين علامة نور لاختبار تأثير تغيير المستويات الداخلية للجين العصبي المعبر عنه الأمومي. تم حقن خمسة mRNAs من Fox D في التجديف السلائف البطنية الثمانية. كما هو موضح هنا ، عبرت غالبية الغرسات البطنية عن SOX اثنين.

على العكس من ذلك ، عندما تم تقليل المستوى الداخلي ل Fox D five عن طريق حقن قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى في مسدفات السلائف الظهرية ذات الخلايا الثماني ، لم يعبر سوى عدد قليل من المقدمات الظهرية عن SOX اثنين. تشير هذه التجارب إلى أن التعبير الأمومي ل Fox D five يلعب دورا في القدرة الجوهرية للمجدفين الظهريين على اكتساب مصير عصبي قبل هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الحقن في Blairs لتشريحها إما mRNAs لاكتساب الوظيفة أو قليل النوكليوتيدات مورفو المضادة للمعنى لفقدان الوظيفة للإجابة على أسئلة إضافية.

على سبيل المثال ، ما هي الجينات المشاركة في القدرة الجوهرية للخلايا على إحداث مصير تنموي محدد؟ بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء اختبار عوامل الإشارات المعروفة عن طريق إضافة عوامل منقاة إلى وسط الاستزراع. يمكن أيضا استخدام هذا النهج لزرع التجديف الفردي في مواقع جديدة في الجنين السليم.

هذا الاختبار ما إذا كانت الخلية المزروعة ملتزمة بمصيرها التنموي الأصلي ، هذه المعلومات ضرورية لتحديد الآليات الخلوية التي تلتزم بها الخلية الجنينية متعددة القدرات بأن تصبح مقدمة لنسيج محدد.