في وقت واحد تسجيلات خلية كاملة من المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الدرجة الثانية في البرمائيات إعداد شريحة الشبكية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير شرائح الأنسجة الرقيقة من شبكية السمندل النمر المائي ، واستخدامها لتسجيلات مشبك جهد الخلية الكاملة المتزامنة من المستقبلات الضوئية والخلايا الأفقية وثنائية القطب من الدرجة الثانية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح عين السمندل أولا وعزل شبكية العين على قطعة من غشاء النيتروسليلوز. الخطوة الثانية هي قطع شرائح رقيقة من شبكية العين ووضعها في غرفة التسجيل.

بعد ذلك ، يتم وضع الغرفة على مجهر ثابت منتصب ويتم وضع ماصات التصحيح فوق شرائح الشبكية. الخطوة الأخيرة هي الحصول على تسجيلات خلية كاملة من خلية أفقية أو ثنائية القطب قبل المشبكي ، والمستقبلات الضوئية ، وما بعد المشبكي. في النهاية ، يمكن استخدام تسجيلات الخلية الكاملة المزدوجة لمعالجة الإطلاق المشبكي ودراسة التفاعلات بين الخلايا في شبكية العين.

تم تطوير تحضير شريحة الشبكية في الأصل في مختبرات فرانك ويربلين وسام وو ، على عكس مستحضرات الخلية المفردة ، احتفظت مستحضرات الشريحة بالاتصال السليم ، وعلى عكس مستحضرات شبكية العين الكاملة ، فإن تقطيع شبكية العين يكشف عن طبقات مختلفة من الشبكية ، مما يسمح بالوصول السهل إلى جميع أنواع الخلايا المختلفة. في شريحة شبكية العين. يمكن استخدام المستحضرات للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية ، بما في ذلك التسجيل المتزامن لخلايا متعددة ولتجارب التصوير.

أثبت هذا المستحضر أنه ذو قيمة كبيرة لدراسة التفاعلات المشبكية بين الخلايا العصبية في الشبكية. في هذا الفيديو ، نصف تحضير الشرائح باستخدام شبكية السمندل النمر ، ونؤكد على بعض التفاصيل الصغيرة التي يمكن أن تحدث فرقا بين النجاح والفشل. ابدأ هذا الإجراء بتجميع الغرفة.

ضع حبتين من الشحوم المفرغة متباعدة من ثمانية إلى 10 ملليمترات عبر غرفة التسجيل لتشكيل قناة للفايز الفائق وتضمين شرائح الريتينول بنبض ثان من الشحوم ، على بعد بضعة ملليمترات من كل من هاتين الحبتين من الشحوم لتكون بمثابة ضريبة للحد من الانتشار. ثم ضع قطعة مثلثة صغيرة من منديل كيم في نهاية الغرفة لضمان ملامسة السوائل للقطب المرجعي. بعد ذلك ، اضغط على قطعة من غشاء النيتروسليلوز بشكل مسطح على المجهر الزجاجي.

انزلق على حبتين صغيرتين من الشحوم المفرغة. لتحضير قطاعة الأنسجة. كسر شفرة الحلاقة ذات الحدين إلى أربع قطع.

ثم نعلق واحد منهم على ذراع التقطيع. تأكد من أن حافة قطع شفرة الحلاقة مسطحة مقابل غرفة التسجيل عن طريق قطع شريحة رقيقة من ورق ترشيح النيتروسليلوز. بعد ذلك ، بعد القتل الرحيم للسمندل عن طريق قطع الرأس ، قم بنواة العين باستخدام زوج من مقص البندقية الصغير تحت المجهر ، وقم بقص الجلد الذي يربط العين بالمدار المحيط.

ثم اسحب العين للأمام وحرك المقص تحتها لقطع عضلات العين والعصب البصري. بعد ذلك ، ضع العين المنزوعة على سرير من القطن على كتلة مشمع. الآن قم بعمل شق صغير في وسط القرنية بشفرة جراحية حادة.

قم بإزالة القرنية عن طريق تحريك مقص البندقية الناعم في الشق وتمديد القطع شعاعيا نحو الهالة سيراتا. ثم قم بقص محيطي حول الهالة serrata عن طريق تدوير كتلة المشمع أو القطن بين الجروح. بعد القص بالكامل حول العين ، قم بإزالة القرنية والعدسة عن طريق سحبها من جانب كوب العين.

انقلي كوب العين المتبقي على سطح صلب من كتلة المشمع المبللة بمحلول ملحي برمائي. قم بتقطيعه إلى أثلاث بشفرة حلاقة حادة بحركة نشر دقيقة للتأكد من أنها تقطع الصلبة. ثم ضع قطعة أو قطعتين من IUP على غشاء النيتروسليلوز بحيث يكون سطح الشبكية متجها لأسفل.

اغمر القطع المتبقية بمحلول ملحي إضافي. بعد ذلك ، ضعيها في الثلاجة في حالة قطع شرائح إضافية لاحقا. الآن ، اضغط برفق على قطعة IUP ضد غشاء النيتروسليلوز باستخدام زوج من الملقط الناعم.

اغمر غشاء النيتروسليلوز وقطعة IUP بعدة قطرات من محلول ملحي برمائي بارد. ثم قم بتصريف المحلول الملحي عن طريق لمس قطعة من كيم ، ومسح على حواف غشاء النيتروسليلوز و iup. بعد ذلك ، اغمر IUP في غشاء النيتروسليلوز بعدة قطرات من محلول ملحي برمائي بارد.

مرة أخرى ، قم بعد ذلك بتقشير ظهارة صبغة الشبكية المشيمية لعزل شبكية العين. إذا لم تلتصق شبكية العين بإحكام ، فقم بتصريف المحلول الملحي بمنديل كيم. من أجل سحب شبكية العين بقوة أكبر على غشاء النيتروسليلوز ، استبدل المحلول الملحي وكرر الإجراء إذا لزم الأمر.

بعد ذلك ، املأ الغرفة بمحلول ملحي برمائي بارد. انقله إلى مرحلة تقطيع الأنسجة. ثم قم بتقطيع شبكية العين وغشاء النيتروسليلوز إلى شرائح رفيعة 125 ميكرون عن طريق الضغط على شفرة الحلاقة برفق ولكن بقوة من خلالها.

بعد تقطيع شبكية العين بأكملها إلى شرائح ، انقل شرائح الشبكية واحدة تلو الأخرى إلى القناة الرئيسية لغرفة التسجيل. لنقل شريحة ، أمسك شريطا من الغشاء في مكانه أثناء تحريك الغرفة تحتها. تأكد من إبقاء الشريحة مغمورة عندما تكون فوق الجزء الأوسط من الغرفة.

قم بتضمين حواف غشاء النيتروسليلوز في شرائط الشحوم المفرغة وتدويرها 90 درجة. لعرض طبقات الشبكية ، اضغط على غشاء النيتروسليلوز بشكل مسطح على السطح الزجاجي ، حتى لو لم يكن هناك شبكية على كل قطعة. ضع شرائح من غشاء النيتروسليلوز على فترات منتظمة حوالي ملليمتر للمساعدة في تفتيت التوتر السطحي وبالتالي تحسين تدفق السوائل.

استمر في نقل الشرائح واحدة تلو الأخرى حتى يتم وضع الشرائح على طول قناة التروية بالكامل. بعد نقل جميع الشرائح ، انقل غرفة التسجيل إلى مرحلة مجهر المرحلة الثابتة المستقيمة. قم بتوصيل سلك القطب المرجعي بسلك أرضي على مرحلة رأس مكبر الصوت.

ركز على الشرائح باستخدام الغمر المائي لمسافات العمل الطويلة من 40 إلى 60 × الهدف. سوبر التالي. قم بدمج الشرائح بمعدل ملليمتر واحد في الدقيقة مع محلول ملحي برمائي ممزوج بالأكسجين.

قم بتوصيل خط الشفط بخط إخراج الغرفة. ثم اضبط التدفق الخارجي لموازنة التدفق عن طريق تدوير الطرف المشطوف لإبرة الشفط أو عن طريق تحريك مسحة kim في نهاية الغرفة بالقرب أو بعيدا عن الفتحة عند طرف إبرة التدفق. افحص الشرائح تحت الضوء الخافت أو الأشعة تحت الحمراء.

بعد ذلك ، حدد زوجا من الخلايا ومستقبلا ضوئيا وخلية أفقية أو ثنائية القطب قريبة للبيع بالجملة. تسجيل ماصة فيليب المعدة قبل التجارب على المحلول داخل الخلايا ، قم بتثبيتها على حامل القطب. بعد ذلك ، ارفع هدف المجهر قليلا.

ضع الماصة المستقبلة للضوء أسفل الهدف. ثم قم بخفضه بحيث يتم وضع الطرف فوق الشريحة مباشرة واضبط التركيز في نفس الوقت. لتجنب الذهاب بعيدا.

كرر هذا الإجراء مع الماصة الثانية. بعد ذلك، تحقق من مقاومة الماصة بنبضة إزالة الاستقطاب من خمسة إلى 10 مللي فولت. اضبط أي إزاحة في مستوى التيار الأساسي على مكبر الصوت.

بعد ذلك ، قم بتطبيق ضغط إيجابي طفيف ، وفي غضون ذلك ، ضع الماصة بعد المشبكي بحيث تلامس جسم الخلية الأفقية أو ثنائية القطب. ثم ضع الماصة قبل المشبكية بحيث تلامس جسم الخلية لقضيب أو مستقبلات ضوئية مخروطية. أثناء مراقبة إطلاق المقاومة ، يكون الضغط الإيجابي على ماصة ما بعد المشبك ، وأحيانا يكون إطلاق الضغط الإيجابي كافيا لتشكيل ختم جيجا أوم.

بعد زيادة مقاومة الطرف إلى أكثر من 100 ميجا أوم ، قم بتطبيق إمكانية الاحتفاظ ب 60 مللي فولت تحت الصفر. ثم عند الحصول على ختم جيجا أم ، قم بإلغاء سعة الماصة العابرة. باستخدام دائرة تعويض السعة لمضخم مشبك الترقيع، كرر إجراء السقف باستخدام ماصة المستقبلات الضوئية، مع تطبيق إمكانات احتجاز تبلغ 70 مللي فولت تحت الصفر وقم بإلغاء سعة الماصة.

عابر، ثم تمزق الرقعة عن طريق تطبيق الشفط على كل خلية. يتضح تمزق الرقعة من خلال ظهور سعة الخلية الكاملة عابرة. الآن ، تأكد من هوية الخلية بعد المشبكية من الناحية الفسيولوجية من خلال تطبيق وميض ضوئي وتقديم سلسلة من خطوات الجهد من سالب 120 إلى زائد 40 مللي فولت بزيادات 20 مللي فولت.

لتقييم ما إذا كانت الخلايا متصلة بشكل متشابك ، قم بتوصيل 25 إلى 100 مللي ثانية 60 مللي فولت. خطوة إزالة الاستقطاب إلى المستقبل الضوئي وابحث عن تيارات ما بعد التشابك العصبي. في الخلايا العصبية من الدرجة الثانية ، فيما يلي الآثار التمثيلية لاستجابات الضوء من الخلايا العصبية في الشرائح الرأسية من شبكية السمندل.

الخلية الأفقية المخروطية والخلية ثنائية القطب تيارا خارجيا استجابة لبداية الضوء. يحدث التيار الداخلي البارز الذي يتبع وميض الضوء في تسجيلات الخلايا الأفقية وثنائية القطب هنا بسبب زيادة إطلاق الغلوتامات من المستقبلات الضوئية لأنها تزيل الاستقطاب عند إزاحة الضوء. تستجيب الخلية ثنائية القطب بتيار داخلي في بداية الضوء ، والتي تنتج عن علامة تعكس إشارات مستقبلات الغلوتامات الأيضية ، وتنشيط قناة ثلاثية واحدة.

يمكن تمييز الخلايا الأفقية والخلايا ثنائية القطب عن بعضها البعض من خلال علاقات الجهد الحالية. عادة ما يكون للخلايا الأفقية علاقات جهد تيار خطية أو مصححة داخليا مع مقاومة إدخال أقل من 500 ميجا أوم ، والخلايا ثنائية القطب لها علاقة جهد تيار مصححة خارجيا ومقاومة إدخال أعلى بين 0.5 إلى جيجا أوم. يوضح هذا الشكل النتائج التمثيلية من تسجيلات زوج الخلايا الأفقية المخروطية وزوج الخلايا ثنائية القطب المخروطي.

في كل حالة ، أدى إزالة الاستقطاب من المخروط إلى 10 مللي فولت تحت الصفر من جهد الاحتفاظ البالغ 70 مللي فولت تحت الصفر إلى إثارة تيار الكالسيوم المسور بالجهد في المخروط وسريع إلى الداخل بعد المشبكي. التيار في شريحة الشبكية للخلية الأفقية أو ثنائية القطب. تم استخدام المستحضرات في مئات الدراسات حول تشريح وعلم وظائف الأعضاء لشبكية العين.

إنها مفيدة بشكل خاص لفحص استجابات الخلايا المتعددة في وقت واحد لأنها تسهل التسجيل والتصوير من خلايا متعددة في نفس الوقت. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح شبكية العين ، وقطع شرائح الشبكية الرقيقة ، ووضعها في غرفة التسجيل ، والحصول على تسجيلات بالجملة من أزواج من ذوات متصلة متشابكية.