الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية
June 10th, 2014
في هذا البروتوكول ، نوضح تصنيع طبقات أساسية لثقافة خلايا القلب المقلدة الحيوية المصنوعة من مادتين بوليمريتين متميزتين باستخدام الطباعة الحجرية للقوة الشعرية. توفر الطرق الموصوفة تقنية قابلة للتطوير وفعالة من حيث التكلفة لهندسة بنية ووظيفة أنسجة القلب العيانية للتطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج طبقات فرعية لزراعة الخلايا الحيوية لهندسة بنية ووظيفة أنسجة القلب عيانية يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع سيد السيليكون أولا بالهندسة الطبوغرافية المطلوبة عن طريق النقش الأيوني التفاعلي العميق. الخطوة الثانية هي نقل النمط الطبوغرافي المطلوب من سيد السيليكون إلى قالب PUA باستخدام الطباعة الحجرية للقوة الشعرية بمساعدة الأشعة فوق البنفسجية.
بعد ذلك ، يتم استخدام قالب PUA كقالب لتصنيع طبقات أساسية لزراعة الخلايا من مواد بوليمرية مختلفة اعتمادا على التطبيق المطلوب عبر الطباعة الحجرية للقوة الشعرية بوساطة الأشعة فوق البنفسجية أو المذيبات. تتمثل الخطوة الأخيرة في وضع خلايا عضلية القلب الأولية أو المشتقة من الخلايا الجذعية على الطبقات السفلية لثقافة الخلايا ذات النمط النانوي للتحليل اللاحق. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الميداني الساطع والتألق المناعي لإظهار التغيرات في مورفولوجيا الخلية وترتيب البروتين التعاقدي داخل خلايا عضلة القلب.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل طباعة التلامس الدقيق ، هي أن الطباعة الحجرية للقوة الشعرية تنتج طبقات فرعية لثقافة الخلايا ذات النمط النانوي يمكن أن تحفز المحاذاة الهيكلية للطبقات الأحادية لأنسجة القلب دون الاعتماد على تكاثر الخلايا أو هجرتها. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتوفير نظرة ثاقبة على علاقة وظيفة البنية لأنسجة القلب ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل علم الأحياء الميكانيكي للسرطان. لدراسة تأثير تضاريس المصفوفة على هجرة الخلايا ، ابدأ هذا الإجراء بتنظيف سطح السيليكون الرئيسي بنسبة 100٪ من الإيثانول أو الزيلين والتجفيف تحت غاز النيتروجين الأكسجين.
بعد ذلك ، ضع جانب نمط السيليكون الرئيسي لأعلى في طبق بتري لسيد السيليكون بماصة نمط سطح سنتيمترين في سنتيمترين 40 ميكرولتر من PUA عليها. ثم ضع ورقة من أربعة سنتيمترات × أربعة سنتيمترات من البوليستر الشفاف فوق PUA الموزع ، واضغط لأسفل على ورقة PET وانشر PUA أسفل الورقة عبر وجه النمط باستخدام أسطوانة أو سطح حافة مسطحة بحيث يتم تغطية النمط بأكمله بواسطة بوليمر PUA المسبق. ثم ضع البوليمر المسبق للسيليكون الرئيسي و PET على بعد حوالي 10 سم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 20 واط لمدة 50 ثانية.
بعد المعالجة ، قم بإزالة فيلم PET ببطء باستخدام الملقط. يجب أن تعلق PUA على فيلم PET مع سلبي لنمط النانو Silicon Master. بعد ذلك ، قم بمعالجة أنماط النانو P-U-A-P-E-T تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 12 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
لتنظيف Silicon Masters ، ضع فيلما آخر من PET فوق السيد دون إضافة PUA. قم بتعريضه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 50 ثانية وقم بإزالة فيلم PET. ثم اشطف سيد السيليكون بنسبة 100٪ من الإيثانول أو الزيلين وجففه تحت غاز النيتروجين الأكسجين.
في هذا الإجراء ، عالج الشرائح الزجاجية الدائرية بقطر 18 ملم عن طريق وضعها في حجرة الأوزون لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، ضع الشرائح على كتل PDMS لتأمينها مؤقتا لسهولة التعامل معها. بعد ذلك ، ضع طبقة من الزجاج التمهيدي على سطح الشريحة الزجاجية.
اترك البرايمر يجف في الهواء لمدة 30 دقيقة. الآن ضع الشرائح الزجاجية على قطعة من ورق الطابعة. قم بإسقاط 10 ميكرولترات من البولي يوريثين المسبق في وسط كل شريحة زجاجية وتأكد من عدم توليد فقاعات.
ثم ضع نمط قالب PUA ووجهه لأسفل على الشريحة الزجاجية ، وقم بتفريق البوليمر المسبق بو بشكل موحد عبر سطح الشريحة الزجاجية عن طريق لف أسطوانة مطاطية على طول قالب PUA. سوف يمتص ورق الطابعة فائض البوليمر بعد ذلك للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 ثانية تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية 20 واط. بعد ذلك ، قم بإزالة العينة من مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية وقم بتقشير قالب PUA بعناية من البلمرة الزجاجية المطلية ب PU ، وتعتبر البلمرة الكاملة للبروريثان.
عندما يتقشر قالب PUA بشكل نظيف بعيدا عن العينة ويكون للشريحة الزجاجية PU مظهر قزحي الألوان ، ضع العينات في مجفف للتخزين لمدة تصل إلى شهر. الآن قم بإرفاق غطاء NFS ينزلق على ماصة طبق البوليسترين سعة 35 ملم لزراعة الأنسجة 20 ميكرولتر من NOA في قاع الطبق. ضع زلة غطاء NPPU برفق فوق NOA واترك الغراء ينتشر وقم بتغطية قاع انزلاق الغطاء بالكامل بعد علاج NOA عن طريق تعريض الطبق للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك ، قم بتعقيم NP SUBSTRATA عن طريق شطفه مرتين بملليلترين من محلول الإيثانول المائي بنسبة 70٪ لكل منهما لمدة خمس دقائق. قم بإزالة الإيثانول عن طريق الشفط. اترك A NFS يجف تماما في الهواء لمدة ساعة تقريبا تحت مصباح التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية.
لتعزيز الالتصاق الخلوي ، قم بتغطية A NFS في الفيبرونيكتين طوال الليل عن طريق تخفيف الفيبرونيكتين أولا في الماء إلى خمسة ميكروغرام لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة ملليلترين من محلول الفبرونيكتين في طبق. ثم ضع A NFS في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
احصل على NR VMs أو HESC CMS أو خلايا القلب الأخرى ذات الأهمية ، وقم بالطرد المركزي لعينة الخلية عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق لتكسير الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط وتأكد من عدم إزعاج الحبيبات. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا في وسط الثقافة إلى تركيز 4.6 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر.
قم بوضع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية بعناية على جهاز A NFS المعقم وتأكد من بقاء تعليق الخلية على زلة الغطاء. بعد ذلك ، ضع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة أربع ساعات للسماح للخلايا بالالتصاق ب A NFS. ثم أضف ملليلترين من وسائط الثقافة الدافئة الإضافية إلى الطبق وضع الخلايا في الحاضنة مرة أخرى في نفس الظروف.
بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسائط واغسلها بملليلترين من DPBS مرتين لإزالة الخلايا الزائدة. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من وسائط الثقافة الدافئة إلى الطبق. ضع الخلايا في حاضنة تحت نفس الظروف والثقافة.
تحل الخلايا التي تلتقي محل الوسائط كل يومين. يوضح هذا الشكل صور المجال الساطع التمثيلية لأجهزة NR الظاهرية بعد سبعة أيام من الثقافة و HESC cms. بعد 48 ساعة من الثقافة ، تظهر NR VMs و HESC CMS على أسطح NP تباين هيكلي واضح ومحاذاة ، في حين أن خلايا عضلة القلب على أسطح نمط الأمم المتحدة موجهة بشكل عشوائي.
يسلط التحليل الكيميائي المناعي الضوء على تأثير تضاريس النانو على محاذاة الهيكل الخلوي للخلية ، وتصبح خيوط الأكتين الدقيقة الأكتين وأكتين ألفا الساركميري في الخلايا المزروعة على A NFS محاذاة على طول حواف النانو ، ولكنها تظل موزعة بشكل عشوائي في الخلايا على طبقات فرعية غير منقوشة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تعقيم طبقاتك السفلية قبل جلوس الخلية لأن التلوث يمكن أن يكون مشكلة كبيرة بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في بيولوجيا القلب والأوعية الدموية لاستكشاف نضوج القلب وخلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج طبقات سفلية لثقافة الخلايا الحيوية عبر الطباعة الحجرية للقوة الشعرية لتطبيقات هندسة أنسجة القلب.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يُظهر هذا البروتوكول تصنيع ركائز زراعة الخلايا القلبية الحيوية باستخدام lithography قوة الشعرية. توفر الطرق الموضحة نهجًا قابلاً للتطوير وفعالاً من حيث التكلفة لهندسة الأنسجة القلبية الماكروسكوبية لمختلف التطبيقات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- هندسة الأنسجة القلبية
- تقنيات زراعة الخلايا
- المواد البوليمرية
الخلفية
- الركائز الحيوية ضرورية لدراسة الخلايا القلبية.
- lithography قوة الشعرية تتيح نمذجة دقيقة.
- هندسة الأنسجة القلبية يمكن أن تحسن الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي.
- استخدام مواد بوليمرية مختلفة يمكن أن يلائم التطبيقات.
غرض الدراسة
- لإنتاج ركائز زراعة الخلايا الحيوية.
- لتصميم هيكل ووظيفة الأنسجة القلبية.
- لتيسيير تحليل سلوك الخلايا العضلية القلبية.
الطرق المستخدمة
- تصنيع قالب رئيسي من السيليكون باستخدام التفريغ التفاعلي العميق بالأيونات.
- نقل الأنماط الطبوغرافية إلى قالب PUA عبر lithography قوة الشعرية المساعد بالضوء فوق البنفسجي.
- تصنيع ركائز زراعة الخلايا من مواد بوليمرية مختلفة.
- زراعة الخلايا العضلية القلبية للتحليل باستخدام تقنيات المجهر.
النتائج الرئيسية
- نقل ناجح للأنماط الطبوغرافية إلى ركائز زراعة الخلايا.
- ملاحظة التغيرات في شكل الخلايا.
- تحليل ترتيب البروتين التعاقدي في الخلايا العضلية القلبية.
- إظهار فعالية الركائز الحيوية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لإنشاء ركائز حيويّة.
- lithography قوة الشعرية هي تقنية متعددة الاستخدامات لهندسة الأنسجة.
- يمكن للدراسات الإضافية تعزيز فهم سلوك الخلايا القلبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nanotopography effects on cardiomyocyte alignment and contractile protein organization.
- Operational Value: Provides cost-effective, scalable substrates for high-throughput assessment of matrix-mediated cellular responses.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating topographic variables in cardiac maturation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological and cytoskeletal readouts via brightfield and immunofluorescence microscopy.
- Operational Value: Delivers reproducible nanopatterned surfaces compatible with primary and stem cell-derived cardiomyocytes.
- Assay Readiness: Facilitates standardized evaluation of compound effects on tissue-level electromechanical coupling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges nanoscale ECM mimicry to functional tissue phenotypes relevant to disease modeling.
- Preclinical Utility: Enables risk-adjusted assessment of regenerative candidates using aligned cardiomyocyte monolayers.
- Mechanistic Insight: Clarifies structure-function relationships without confounding effects from cell proliferation or migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports functional target validation through controlled nanotopography-induced phenotypic modulation.
- Screening: Delivers standardized, alignment-inducing substrata for consistent compound screening in cardiac assays.
- Analytics: Provides quantitative imaging-based readouts for assessing cytoskeletal alignment and sarcomeric organization.
- Translational Research: Connects nanoscale substrate design to preclinical-relevant tissue maturation endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiovascular target validation across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue engineering by decoupling topographic cues from biochemical signals.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility via UV-assisted and solvent-mediated capillary force lithography processes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing predictive, human-relevant in vitro models.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement of cardiac regenerative candidates based on functional tissue metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, polymer chemistry, and cell culture techniques.
- Depends on UV curing equipment, precision molding tools, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and sterilization protocols across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to non-cardiac cell types or disease models.
- Limited by the need for specialized masters and molds, though scalable via replication.
