واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات في الجسم الحي استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

الهدف من هذا الإجراء هو الحصول على صور مضان بفاصل زمني لمستعمرات الإشريكية القولونية المتنامية ، والتعبير عن تركيبات المسار المشترك لتحديد عدد جزيئات البروتين المنتجة حديثا. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد عينة من الخلايا أولا ، وتعبير coex عن بروتين ذي أهمية مدمج مع مراسل كورا الفلوري ، وبروتياز ينشق على وجه التحديد بين مراسل كورا والبروتين محل الاهتمام. الخطوة الثانية هي تحضير هلام بدرجة حرارة انصهار منخفضة Aris مصنوع من M تسعة وسائط بسيطة.

بعد ذلك ، يتم تحضير وسادة جل AROS للاستخدام مع غرفة عينة يتم التحكم في درجة حرارتها. توضع خلايا الإشريكية القولونية على الجل ويتم تجميع الغرفة. الخطوة الأخيرة هي وضع الغرفة على مجهر مضان وتصوير العديد من مستعمرات الخلايا النامية على فترات منتظمة على مدى أجيال متعددة.

يتم استخدام جزيئات تقرير TRE المنتجة حديثا في كل فترة من كل إعادة في النهاية للحصول على آثار زمنية لإنتاج البروتين في خلايا الحياة ذات الجزيء الفردي ودقة الخلية الواحدة. تتمثل ميزة هذه التقنية على مقاييس الخلية المفردة السابقة باستخدام اندماج البروتين الفلوري في أنه يمكن متابعة إنتاج أي سرطان لجزيئات البروتين بإجراء الجزيء الفردي والنتيجة التي تؤثر على وظائف الجزيئات. لهندسة تسلسلات إدراج السلالة ، وترميز تسلسل توطين الغشاء ، وبروتين فلوري سريع النضج ، وتسلسل التعرف على البروتياز ومحطة إلى الإطار وفيه مع بروتين ذي أهمية في هذه الحالة المحددة ، عامل نسخ أو tf.

في هذا الإجراء ، تم استخدام المراسل الوريدي TSR المستهدف بالغشاء. تم دمج المراسل في تسلسل التعرف على البروتياز يوبيكويتين لحساب عدد البكتيريا المعبر عنها Lambda Repressor ، C جزيئات البروتين واحد. بعد دمج البناء في كروموسوم الإشريكية القولونية ، يتم تحويل ترميز البلازميد للبروتياز الخاص بتسلسل التعرف إلى سلالة تعبر عن مراسل الفلورسنت والبروتين ذي الأهمية في الاندماج الانتقالي.

في هذا البروتوكول ، تم استخدام البروتياز يوبيكويتين كربوكسي هيدرو واحد ، والذي ينشق مباشرة بعد بقايا اليوبيكويتين الطرفية C. لبدء هذا البروتوكول ، اختر مستعمرة واحدة من صفيحة أجار حديثة إلى مليلتر واحد M تسعة ، الحد الأدنى من الوسط المكمل بواحد × الحد الأدنى من الأحماض الأمينية المتوسطة الأساسية والمضادات الحيوية المناسبة. احتضان شاكر عند درجة الحرارة المطلوبة لفترة كافية للوصول إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر أو OD 600 أكبر من 1.0.

ثم قم بتخفيف المزرعة إلى مليلتر واحد من وسط M تسعة طازج مع المضادات الحيوية المناسبة إلى OD 600 من 0.02. من خلال احتضان شاكر عند درجة الحرارة المناسبة ، يمكن زيادة الكثافة الخلوية الأولية إذا لزم الأمر لنمو درجات الحرارة المنخفضة. عندما يساوي OD 600 0.2 إلى 0.3 ، ابدأ في تحضير وسادة هلام ARO عن طريق وزن 10 إلى 20 ملليغرام من درجة حرارة الانصهار المنخفضة في أنبوب صغير سعة 1.5 ملليلتر.

أضف الحجم المناسب M تسعة ، الحد الأدنى من الوسط بدون مضادات حيوية لعمل محلول نشأ بنسبة 3٪. ثم سخني المحلول المنشأ لمدة 30 دقيقة عند 70 درجة مئوية حتى يذوب. اقلب الأنبوب للتأكد من ذوبان المحلول تماما ومتجانس.

لتجميع وسادة الجل ، اشطف زجاجا واحدا من زجاج الغطاء المنظف مسبقا وشريحة قناة مائية صغيرة بالماء المعقم. جفف زجاج الغطاء وانزلق عن طريق النفخ بالهواء المضغوط. ضع الحشية المطاطية على شريحة القناة الصغيرة بحيث تغطي المداخل والمخارج.

على الجانب الزجاجي من الشريحة ، ضع 50 ميكرولترا من محلول ARO على مركز القناة الصغيرة. حرك محلول ARO فوق زجاج الغطاء الجاف النظيف. دع المحلول الزراعي يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

عندما تصل الخلايا إلى OD 600 من 0.3 إلى 0.4 ، تكون جاهزة للتصوير. انقل ملليلترا واحدا من الثقافة المحتضنة إلى جهاز طرد مركزي أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر عند 10،000 مرة G، لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. بعد التخلص من عامل SUP ، أضف ملليلترا واحدا من متوسط M تسعة طازج وإعادة التركيب.

قم بتعليق الحبيبات برفق ، وقم بالطرد المركزي للتعليق مرة أخرى عند 10 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. ثم كرر خطوة الطرد المركزي resus مرة أخرى ، وأعد تعليق الحبيبات برفق في ملليلتر واحد من M تسعة متوسط. في هذه المرحلة ، يمكن استخدام الخلايا للتصوير المجهري أو تخفيفها من 10 إلى 100 ضعف لضمان كثافة الخلايا المنخفضة للتصوير بفاصل زمني.

لتحضير عينة للتصوير ، انزع زجاج الغطاء بعناية من أعلى وسادة الجل. أضف ميكرولتر واحد من مزرعة الخلايا المغسولة إلى الجزء العلوي من وسادة الجل. انتظر لمدة دقيقتين تقريبا حتى تمتص وسادة الجل المزرعة.

من المهم عدم الانتظار طويلا حتى تجف وسادة الجل. سيختلف الوقت المثالي باختلاف درجة الحرارة والرطوبة أثناء الانتظار حتى يجف. زجاج غطاء آخر تم تنظيفه مسبقا.

بمجرد تجفيف العينة ، قم بتغطية العينة بزجاج الغطاء الجديد مع التأكد من محاذاة زجاج الغطاء وشريحة القناة الصغيرة بشكل جيد. قم بتجميع غرفة النمو التي يتم التحكم في درجة حرارتها باتباع تعليمات الشركة المصنعة. يمكن استخدامه الآن للتصوير على المجهر.

لبدء التصوير ، قم بتشغيل الليزر والمجهر باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قفل الغرفة المجمعة على إدراج المسرح على المجهر. اضبط درجة حرارة غرفة النمو والسخان الموضوعي على 37 درجة مئوية أو درجة حرارة نمو أخرى مطلوبة.

إذا كان التصوير أعلى من درجة حرارة الغرفة ، فعادة ما ينجرف التركيز البؤري أو حشوة الهلام بشكل كبير لمدة 15 دقيقة تقريبا بعد التحول الأولي في درجة الحرارة. في الممارسة العملية. استخدم هذا الوقت للعثور على مناطق الاهتمام وتعديل البرامج النصية للتصوير حسب الضرورة.

لإجراء تجربة. اضبط شدة الإثارة بالليزر بحيث يتم تبييض جميع جزيئات الفلورسنت تقريبا في غضون ستة تعرضات. ابحث عن الخلايا على المجهر وقم بتوسيطها داخل منطقة تصوير محددة مسبقا ومحاذاة.

ثم قم بتخزين موضع كل خلية ، ويمكن تصوير أكثر من خلية واحدة في كل صورة. تضمن النافذة الزمنية للاستحواذ للتصوير بفاصل زمني على مدى أجيال عديدة فصل خلايا الصورة في البداية عن الخلايا الأخرى ، ولكن على الأقل بضع مئات من الميكرونات بحيث لا تدخل المستعمرات الأخرى منطقة التصوير أثناء النمو. باستخدام برنامج نصي للتصوير الآلي، احصل على بيانات اللقطات المتتابعة باستخدام الخوارزمية الموضحة في سير العمل التجريبي هذا، والتي يمكن العثور عليها في بروتوكول النص المصاحب لهذا الفيديو.

تعرض هذه الصور بيانات الفاصل الزمني النموذجية من تجربة تتبع التعليمات البرمجية. يتم عرض صور من مستعمرة واحدة على فترات 25 دقيقة. في هذه التجربة ، تم الحصول على البيانات كل خمس دقائق من 12 مستعمرة مختلفة.

تمثل هذه الصور صورا للحقل الساطع وصور فلورة Venus YFP مع طرح متوسط الخلفية لحساب التغيير في خلفية مجال التصوير بأكمله. بمرور الوقت عندما يتم تراكب الصور ، فإنها تكشف عن توطين القطب لجزيئات مراسل UB الوريدية TSR وعدم التجانس في عدد الجزيئات المنتجة في نوافذ زمنية مدتها خمس دقائق في خلايا مختلفة. تظهر هنا بيانات نموذجية من نقطة زمنية واحدة في تجربة مسار الكود ، يتم عرض صور التألق الوريدي لستة تعريضات 100 مللي ثانية تم الحصول عليها في بداية كل فاصل زمني لمدة خمس دقائق.

تم فصل كل من التعرضات الستة بمقدار 900 مللي ثانية لإتاحة الوقت للجزيئات الوريدية الداكنة العابرة التي تومض لتصبح فلورية للتحليل. يتم طرح الصورة السادسة من الصورة الأولى لتصحيح الجزيئات غير المبيضة والتألق الذاتي. يتم توطين بقع الخلفية في هذه الصورة إلى سلالات خلايا معينة ويتم تحديدها كميا من خلال شدة التألق المتكاملة.

ثم يتم رسم متوسط التألق المتكامل للمستعمرة على ست صور تناسب هذا الخط مع الاضمحلال الأسي. بالإضافة إلى أن الإزاحة الثابتة تعطي شوطا من ثانية واحدة تقريبا. في هذه التجربة ، يتم تبييض الجزيئات الوريدية بسرعة أكبر بكثير من التألق الذاتي الخلوي.

لذلك ، يتم تبييض ما يقرب من نصف العدد الإجمالي للجزيئات الوريدية في كل إطار. في هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليل التصوير الكهربيني في حالات أخرى لإنشاء مقاييس لعدد جزيئات البروتين المنتجة في الخلايا المفردة.