يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في ذبابة الفاكهة البويضات

في هذا البروتوكول ، يتم تشريح الخلايا التي تعبر عن البروتينات الموسومة ب GFP من ذبابة الفاكهة الأنثوية وتصويرها لدراسة حركة البروتين في الخلايا الحية. أولا ، قم بإعداد غرفة عرض عن طريق لصق زلتين للغطاء على شريحة باستخدام شحم السيليكون لتشكيل قناة. جوانب القناة مبطنة بزيت الكربون هالة.

بعد ذلك ، قم بتشريح المبايض من أنثى إلى قطرة من زيت الكربون هالة على زلة غطاء. ثم اعزل الخلايا الفردية واقلب زلة الغطاء فوق القناة في الشريحة المعدة لإنشاء غرفة عرض. بعد تحديد موقع الخلايا باستخدام بصريات المجال الساطع أو DIC ، التقط صورا رقمية على فترات زمنية محددة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر والبرامج المرتبطة به.

في النهاية ، يمكن استخدام تسلسل الفاصل الزمني للصور التي تم إنشاؤها لمراقبة حركة البروتينات أو الجسيمات في الخلايا الحية بمرور الوقت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التحقيق في المجالات الرئيسية في بيولوجيا الخلية والتنموية ، مثل تهريب البروتين والحمض النووي الريبي المرسال ، وإنشاء قطبية الخلية. قم أولا بتخدير الذباب السليم الذي يقل عمره عن أسبوع واحد واختر 10 إلى 15 أنثى كبيرة ذات بطن مستديرة بلون كريمي.

انقل الذباب المختار وعدد قليل من الذكور إلى قارورة تحتوي على طعام جديد مخمر قليلا. ثم احتضان الذباب لمدة يومين عند 25 درجة مئوية للتسمين. يضمن تسمين الذباب أن مجموعة متنوعة من المراحل ، وخاصة المرحلة من الثامنة إلى 12 ، متاحة لتصوير الذباب غير المسمن أو الذباب غير المسمن عادة ما يحتوي فقط على مراحل مبكرة جدا وخلايا ناضجة باستخدام شحم السيليكون.

قم بلصق غطاءين على بعد سنتيمتر واحد تقريبا على شريحة زجاجية قياسية. استخدم فقط ما يكفي من الشحوم لضمان إحكام جيد بين انزلاق الغطاء والانزلاق. اضغط بقوة على كل زلة غطاء لتوزيع الشحوم بشكل رقيق ومتساوي.

ثم أضف بعض زيت الكربون المقدس 27 إلى المنعطف بين زلات الغطاء والانزلاق لمنع إصابة الخلايا المعزولة في الخطوات اللاحقة. الآن ضع قطرتين إلى ثلاث قطرات من زيت الكربون 27 على سطح زلة غطاء 22 ملليمتر مربع. ماصة الفم التالية أنثى فردية من قارورة الطعام وتودع برفق في زيت هالة كارون.

باستخدام ملقط تشريح حاد ، قم بتثبيت الذبابة على زلة الغطاء واسحب طرف البطن. قم بإزالة المبايض عن طريق سحبها على طول سطح زلة الغطاء أسفل الزيت لتعزيز التصاق الخلايا بزلة الغطاء. الآن قم بفصل المبايض برفق بحثا عن الخلايا التي لا تقل عن المرحلة 10 ب من تكوين البويضات.

حدد البويضات في هذه المرحلة من خلال البحث عن غرف البيض التي تشغل فيها البويضة ما لا يقل عن 50 إلى 60٪ من الحجم الكلي لغرفة البيضة. باستخدام ملقط. قم بإزالة البويضات الفردية من الغمد البيضوي باستخدام إناث واحدة إلى ثلاث إناث.

استمر في عزل خمسة إلى ثمانية بويضات غير تالفة على زلة الغطاء. ثم قم بإزالة أي أنسجة غير صالحة للاستعمال. اقلب زلة الغطاء التي تحتوي على البويضات بعناية على الشريحة المعدة مسبقا بحيث يتم وضع السيات بين الفواصل.

وتذكر ، لا تضغط لأسفل على زلة الغطاء لأنها يمكن أن تتلف الصودات إذا لزم الأمر ، أضف كمية صغيرة من زيت هالة الكربون إلى حواف الساندويتش لضمان ملء الفراغ. لاحظ أنه في هذه المرحلة من تكوين البويضات ، أصبحت خلايا البصيلات التي تغطي البويضة مجبرة وتحيط بالبويضة من جميع الجوانب ، باستثناء منطقة صغيرة حيث تبقى الروابط بالخلايا الممرضة. اجعل البويضة في التركيز باستخدام DIC أو بصريات تباين الطور.

افحص البويضة بحثا عن أي علامات تلف، مثل تسرب السيتوبلازم أو انتفاخ خلايا البصيلات. قم بتصوير البويضات التي تبدو صحية وغير تالفة فقط. لمراقبة البث مباشرة بدون وضع العلامات على GFP.

قم بتعيين الصور الملتقطة في نطاق ZI من النطاق بإعدادات كسب أعلى من تلك المستخدمة للبروتينات المسماة GFP. استخدام الأهداف الجوية لتقليل الانجراف وحركة العينة بشكل كبير. احصل على أقسام بصرية أسفل سطح البويضة مباشرة.

بمجرد التركيز على منطقة الاهتمام ، قم بإيقاف تشغيل بصريات المجال الساطع وقم بالتبديل إلى التصوير متحد البؤر باستخدام وظيفة معاينة المسح السريع للبرنامج ، واضبط التركيز والكسب حسب الضرورة. أيضا ، قم بتعيين معلمات الإثارة والطول الموجي والطول الموجي للانبعاث. لالتقاط المحور Z، حدد محورا Z ثابتا مع تأخر 10 ثوان بين الإطارات.

بعد التقاط تسلسل فاصل زمني نموذجي يتراوح بين 20 و 50 إطارا ، قم بمراجعة جودة الفيديو وتقييمها على الفور. تظهر صورة الفاصل الزمني الفردي هذه بويضة المرحلة 11. هذه البويضة التي تعبر عن البروتين الموسوم ب GFP R TNL يمكن أن تنتج إشارة قوية.

يبدو أن R TNL واحد يتشارك في التوطين مع الأنابيب الدقيقة الطويلة الموجودة أثناء التدفق البلازمي. عادة ما يكون التدفق البلازمي المرجعي في غرفة البيض من النوع البري واضحا كحركة ملحوظة لحويصلات ylk ذاتية الفلورسنت كما هو موضح في الإسقاط الأقصى الخمسة إطارات لغرفة بيضة المرحلة 10 B. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الأنثوية السليمة التي تعبر عن البروتينات الموسومة ب GFP ، وكيفية تحضير عينات للتصوير المباشر ، وكيفية التقاط مقاطع فيديو بفاصل زمني للبروتينات والجزيئات الفلورية.