قياس نفاذية كبيبي الجزيئات نيون باستخدام المجهر 2 فوتون في ميونيخ فئران ويستار

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وحدة الترشيح في النيفرون بنجاح وتحديد ترشيح الجزيئات الكبيرة الفلورية عبر حاجز الترشيح في الفضاء البولي في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد مرحلة المجهر أولا للحيوان الحي. بعد ذلك ، تتعرض الكلية ويوضع الجرذ على المسرح.

ثم يتم تحديد الكبيبات الفردية وتعيينها والحصول على صور ثلاثية الأبعاد في الخلفية. أخيرا ، يتم غرس ألبومين الفلورسنت. يتم الحصول على أحجام ثلاثية الأبعاد من الكبيبات الفردية ، ويتم تحديد النفاذية.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر معامل ترشيح الجزيئات الكبيرة عبر الكبيبات في الكلى من خلال استخدام الفحص المجهري داخل قارورتين. الميزة الرئيسية لاثنين من المجهر الفوتوني هي أنه يسمح بالقياس الكمي المتزامن لكل من الترشيح الكبيبي وإعادة الامتصاص الأنبوبي القريب وانتقال الفعل الخلوي في. في الوقت نفسه ، تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى ما هو أبعد من الميكانيكية إلى التشخيصية والعلاجية مثل أهمية فهم كل من دور الترشيح الكبيبي والأنبوب القريب.

إعادة امتصاص الألبومين أمر بالغ الأهمية في تحديد استهداف العلاج. بعد تخدير الجرذ ، أدخل خط وصول وريدي ساكن من خلال الوريد الوداجي أو الفخذ واحلق الجناح الأيسر من أسفل القفص الصدري مباشرة إلى أعلى الفخذ الأيسر مباشرة. هذه جراحة غير قابلة للبقاء على قيد الحياة.

ضع الجرذ بشكل مسطح على جانبه الأيمن بحيث يكون الجانب الأيسر المحلوق متجها لأعلى. تأكد من أنها مسطحة على المقعد مع وضعيتها ممدودة وليست رابضة مع الكفوف الأمامية التي تلامس بعضها البعض والكفوف الخلفية تلامس بعضها البعض برفق شديد. المس الكلية لتحديد مكانها بشكل طبيعي داخل خلف الصفاق ، واستخدم شاربي لرسم خط مستقيم مواز للجسم باستخدام زوج من ملقط الأسنان.

التقط الجلد واستخدم زوجا من المرقئ لقرص الجلد على طول الخط المرسوم لسحق الأنسجة ومنع النزيف باستخدام مقص جراحي. قطع على طول الشق. استخدم نفس الإجراء لقطع طبقة العضلات الخارجية الرقيقة حسب الحاجة.

استخدم مرقئ لمنع نزيف الشق في الطبقة العضلية الداخلية ، مما يكشف الصفاق. أعد ملامسة الكلى لتقدير الحجم. اضغط على خط شق أصغر من الكلى للتأكد من أن الشق فوق الكلى مباشرة.

من الأفضل جعل هذا الشق صغيرا جدا وجعله أكبر إذا لزم الأمر. حدد موقع الكلى واستخدم الملقط للإمساك بالدهون المحيطة باتجاه القطب السفلي للكلية بطريقة اليد على اليد. بمجرد الوصول إلى القطب السفلي للكلية ، اسحب الكلية برفق من خلال الشق مع الضغط برفق شديد أسفل الكلية لإخراجها من الخارج.

إذا كان الشق صغيرا جدا ، فقم بسحق طبقة العضلات وقطعها لتوسيعها. كرر الإجراء لإخراج الكلى من الخارج بعد إخراج كلية الفئران ووضع الجرذ على مرحلة المجهر للتصوير. إذا كان المجهر الخاص بك مزودا بمرحلة آلية قادرة على تحديد المواقع ، باستخدام قضيب الفلورسين مزدوج التمرير ، ومرشح الدومين ، وهدف منخفض الطاقة ، فابحث عن الكبيبات الفردية وتوسيطها ، والتي ستظهر كهياكل دائرية فارغة محاطة بأنابيب قريبة.

وجود التألق الذاتي البرتقالي الأصفر المتأصل في كل موقع ، وقم بتبديل البرج إلى هدف غمر في الماء عالي الطاقة ، وأخذ مجموعات بيانات ثلاثية الأبعاد لكل كبيبات. التأكد من أن الحلقات الشعرية ومساحة بومان مرئية بوضوح. سيساعد استخدام لوحة ألوان زائفة على تصور هذه الهياكل.

بعد ذلك ، مع التركيز على وعاء دموي سطحي ينقع ببطء الألبومين الفلوري ، مع التأكد من إعطاء الوقت للسماح بالتوزيع الجهازي للجزيئات ذات معامل الكبيبي المنخفض أو GSC ، من الضروري تعظيم قيم الشدة في البلازما ، ولكن ليس للوصول إلى المستويات التي من شأنها تشبع أجهزة الكشف عن الصور في المجهر. هذا يزيد من قابلية اكتشاف الجزيئات المفلترة بعد الانتظار حوالي 10 دقائق للسماح لأي شظايا صغيرة محتملة بالوزن الجزيئي بالمسح ، احصل على أحجام ثلاثية الأبعاد على فترات ميكرون واحدة لاستخدامها في حساب الألبومين باستخدام برنامج معالجة الصور المتحول. قم بتحميل مجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد جنبا إلى جنب مع صور الخلفية لكل كبيبات في وحدة التخزين التي تحتوي على الألبومين الفلوري.

حدد موقع حلقة شعرية سطحية مع مساحة فارغة كافية بين هوامشها المحددة وحافة كبسولة بومان. في وحدة تخزين الخلفية. حدد موقع نفس المستوى البؤري ، والذي يجب أن يحتوي على جميع الإشارات المرئية للألبومين الذي يحتوي على الصورة.

حدد منطقة داخل الحلقة الشعرية محل الاهتمام ولاحظ قراءة متوسط الشدة. بعد ذلك ، حدد منطقة داخل مساحة Bowman ولاحظ متوسط قراءة الكثافة. سيتم استخدامها كقيم أساسية للقياس الكمي.

حدد المنطقة المماثلة داخل مساحة Bowman في الألبومين الذي يحتوي على صورة. افعل ذلك لمنطقتين أخريين على الأقل للحصول على قيمة لمتوسط الشدة داخل مساحة بومان. حدد الحلقة الشعرية ذات ألمع شدة البلازما وارسم منطقة حولها.

بعد ذلك ، باستخدام وظيفة العتبة ، قم بتمييز القيم الساطعة داخل البلازما المنتشرة ، وتجنب الخطوط الداكنة التي تنتشر في خلايا الدم الحمراء. لاحظ متوسط قيم الشدة لمساحة البلازما المحددة. من المهم تحديد المناطق الساطعة من البلازما بشكل تفضيلي لأن العوامل الموجودة داخل الدم ستعمل فقط على التقليل من مستويات مضان البلازما.

أدخل القيم في جدول بيانات Excel لحساب GSC حيث يساوي GSC فرق مساحة الرامي الخام. شدة ناقص شدة مساحة الخلفية بومان مقسومة على الفرق في شدة الحلقة الشعرية الخام مطروحا منها شدة حلقة الشعيرات الدموية للخلفية. يحدث امتصاص الألبومين الفلوري المفلتر في الغالب في الجزء المبكر من الأنابيب القريبة.

تظهر هذه اللوحة S ، مقطعا عرضيا من الكبيبة وقطعة S واحدة مأخوذة من فأر ميونيخ ويستار ، بعد حوالي 20 دقيقة من ضخ بلعة RSA أحمر أولية من تكساس. يظهر افتتاح مساحة Bowman والامتصاص المتعطش للألبومين باللون الأحمر في الجزء S واحد. تظهر هذه اللوحة إسقاطا ثلاثي الأبعاد ضحلا بحجم 20 ميكرون لنفس مجموعة البيانات ، ويظهر هنا إسقاط طاقة أقل تم أخذه بعد حوالي 60 دقيقة من التسريب.

توضح هذه الصور أن الفحص المجهري داخل الحيوية يمكن أن يسمح بتصور مصير المواد المنقوعة بعد تأكيد الترشيح إلى حد ما ، ومعامل الترشيح الذي لوحظ الموضح هنا هو صور مأخوذة من الكبيبة السطحية. هذه اللوحة عبارة عن صورة خلفية وقد التقطت هذه الصورة بعد حوالي 12 دقيقة من ضخ ألبومين مصل الفئران الأحمر في تكساس. تم رسم هاتين اللوحتين بلون زائف.

يتم استخدام ثلاث مناطق صغيرة ذات أهمية مرسومة في مساحة بومان لحساب متوسط كثافة الألبومين الفلوري الذي تحرك عبر حاجز الترشيح. تم الإبلاغ عن متوسط قيم الكثافة للمناطق الفردية في المنطقة المميزة ضمن مربع الحوار عرض منطقة الإحصائيات. تقع قيمة GSC للألبومين البالغة 0.0111 المشتقة من هذه الكبيبة الفردية ضمن مشهد النطاق في هذه السلالة من الفئران النجمية في ميونيخ عندما تكون في حالة التغذية.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحليل الكمي والنوعي على الهياكل الكلوية الأخرى للإجابة على أسئلة إضافية مثل الاتجار النهائي للجزيء الكبير بعد الترشيح في الفضاء البولي بعد تطوره. سمحت هذه التقنية للباحثين في علم وظائف الأعضاء الكلوي باستكشاف العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية الديناميكية ، ليس مرة واحدة فقط ولكن طوليا. بمرور الوقت ، كان كذلك.