الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

يوفر هذا النظام التجريبي منهجية إنتاجية عالية لمراقبة السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية على مستوى الخلية الواحدة. أولا ، قم بتسمية المستجيب الخلايا التائية والخلايا المستهدفة للورم بقوالب الأصباغ الفلورية. قم بتحميل كلا النوعين من الخلايا على مصفوفات آبار النانو واغمر الشريحة بأكملها في وسط يحتوي على cyt green و cyt green و nexin المسمى بالفلورسنت. خمسة.

من أجل تحديد كل من الخلايا النخرية والخلايا المبرمجة ، قم الآن بتسجيل صورة أولية مسبقا لتحديد شغل البئر وصلاحية الخلية في بداية الفحص. بعد ست ساعات ، سجل صورة ثانية. ثم استخدم تحليل الصور الآلي لتحديد التحلل الخاص بالمستضد ل EL four CD 19 إيجابي بواسطة الخلايا التائية الإيجابية للسيارة.

يمكن للنتائج التي تم الحصول عليها من طريقة الإنتاجية العالية هذه فحص التحلل الخاص بالمستضد للأهداف بواسطة الخلايا المستجيبة بناء على التلوين الإيجابي بالسيتوكسين. خمسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل اختبار إطلاق الكروم 51 هي أنه يمكن تحقيق تفاعلات مستهدفة فعالة حقيقية فردية وقياس تردد الأقمار الصناعية يمتد تأثير هذه التقنية إلى أي علاج للسرطان لأنه يسمح بدراسة ارتباطات الفعالية في العلاج بالخلايا الذاتية لتصنيع آبار النانو باستخدام سيد السيليكون أولا قم بخلط قاعدة مجموعة المطاط الصناعي السيجار 180 4 وعامل المعالجة في أ نسبة وزن 10 إلى واحدة في كوب يمكن التخلص منه باستخدام سكين بلاستيكي. ينزع الخليط في غرفة مفرغة لمدة ساعة.

ثم اسكب الخليط على سيد السيليكون واتركه لمدة 30 دقيقة. الآن لمعالجة المطاط الصناعي ، قم بتسخين التجميع في فرن 80 درجة مئوية لمدة ساعتين بعد التبريد في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. قم بإزالة مصفوفة بئر PDMS nano بعناية من سيد السيليكون.

قم بتغطيته بشريط لاصق حتى الاستخدام قبل يوم من مرور التجربة 5 ملايين خلية مستهدفة في خمسة ملليلتر. يوم التجربة. بيليه 5 ملايين خلية في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مليلتر عن طريق الطرد المركزي عند 340 جي لمدة خمس دقائق.

استنشق الوسائط الزائدة تاركا وراءه ما يقرب من 50 ميكرولترا من الوسائط لتسمية الخلايا. أضف 150 ميكرولترا من محلول العمل الأحمر لتتبع الخلايا الطازجة واخلطه جيدا باستخدام ماصة P 200 لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، قم بتعداد الخلايا المستجيبة التي يتم حصادها من الثقافة.

ثم بيليه 5 ملايين خلية في أنبوب مخروطي معقم 15 مليلتر عن طريق الطرد المركزي. استنشق الوسائط الزائدة. ثم أضف محلول عمل جديد من خمسة ميكرومولار نابضة بالحياة D دورة بنفسجي وتعليق التثبيت باستخدام ماصة P 200.

احتضان الخلايا وتموت لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 6.8 مل و 6.0 مل من R-P-M-I-P-L-G-H لاستهداف الخلايا والمستجيبة على التوالي وخلطها عن طريق سحب العينات. ثم قم بوضع طبقة ببطء 3.5 مل من عبوة الخيوط بالإضافة إلى قاع كل أنبوب ، وقم بالطرد المركزي كلا الأنبوبين عند 340 GS لمدة 30 دقيقة دون انقطاع وتسارع أثناء الطرد المركزي ، وقم بإعداد مجموعة الآبار النانوية أولا ، انقل سبعة ملليلتر من PBS قبل الحرب إلى لوحة بأربعة آبار. نظف الجزء السفلي من الشريحة الزجاجية بالإيثانول باستخدام مؤكسد البلازما.

عالج PDMS عند إعداد التردد اللاسلكي العالي لمدة 30 إلى 45 ثانية. ثم ضع المصفوفة في PBS. انقل اللوحة إلى خزانة السلامة الحيوية واستنشق PBS الزائد ، ضع أجار نبيل دافئ بنسبة 1٪ على الحواف العلوية والسفلية للشريحة الزجاجية لشل حركة المصفوفة.

تأكد من عدم ترك PDMS يجف بعد 10 دقائق عند ثلاثة ملليلتر من PBS واستنشاق الأجار الزائد. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من R 10 إلى الجزء العلوي من مصفوفة بئر النانو وقم بالتوازن لمدة 10 دقائق تقريبا. بعد الطرد المركزي Fial ، استنشق خمسة ملليلتر من الوسائط من الطبقة العليا لكل أنبوب.

الحرص على عدم شفط الطبقة التي تحتوي على الخلايا بماصة P 1000. احصد الطبقة البيضاء من الخلايا بين القرص والوسائط. نقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية معقمة جديدة.

الآن اغسل المستجيب المحصود والخلايا المستهدفة مرتين بثلاثة ملليلتر من R-P-M-I-P-L-G-H قبل الحرب. بعد الطرد المركزي النهائي ، قم بشفط الوسائط الزائدة وإعادة تعليق حبيبات الخلية. في 500 ميكرولتر من R 10 ، عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد trian blue على مقياس الخلوي الدموي ، واستنشق الوسائط الزائدة من مجموعة النانو.

ثم أضف ملليلترين من شفط R 10 الطازج. مرة أخرى ، تأكد من أن الجزء العلوي من مصفوفة النانو ليس رطبا جدا ولا جافا جدا لأنه سيؤثر على توزيع الخلايا. الآن قم بإيداع واحد في 10 إلى خمس الخلايا الفيكتور في 200 ميكرولتر من R 10 على سطح مصفوفة النانو ، مما سمح للخلايا بالاستقرار لمدة خمس دقائق.

ثم باستخدام مجهر زراعة الأنسجة القياسي ، تحقق من التوزيع المطلوب للخلايا. بعد ذلك ، قم بالإيداع مرة واحدة في 10 إلى الخلايا المستهدفة الخامسة في 200 ميكرولتر من R 10 على سطح مصفوفة بئر النانو التي تحتوي على الخلايا المستجيبة. بعد خمس دقائق ، قم بتقييم توزيع الخلايا عن طريق الفحص المجهري.

ثم اشطف مجموعة النانو جيدا بعناية باستخدام ملليلترين من R 10 واستنشق الوسائط الزائدة في أنبوب مخروطي معقم منفصل سعة 15 مل. ماصة ثلاثة ملليلتر من التدفئة R 10 عند ثلاثة ميكرولترات من 0.5 مللي مولار ، وصمة عار الحمض النووي الأخضر ، و 60 ميكرولترا من X في خمسة LOR 6 47 ممزوجة جيدا عن طريق سحب العينات. الآن قم بتقطيع محلول البقعة برفق على لوحة الآبار الأربعة ، مع التأكد من عدم إزاحة الخلايا من الآبار التي تحتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ويحصل ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ على صور لمجموعة الآبار النانوية باستخدام مجهر مضان مثل مجهر zes observer Z واحد ، المجهز بمرحلة آلية و Lambda DG four.

تهيئة البرنامج والمجهر. تحقق من شدة الإشارة على الضوء المرسل وقنوات الفلورسنت الأخرى. اضبط إعداد المجهر لضمان أقصى إشارة للضوضاء مع تجنب التشبع.

افتح الآن قائمة المواضع x و Y لمصفوفة nelle. اضبط موضع XY صفر وقم بتصفير التركيز على مركز كتلة مصفوفة سبعة × سبعة في الزاوية العلوية اليسرى من طابع مصفوفة nelle. قم بتعيين مواضع XY لتتزامن مع مركز كل كتلة وقيمة Z لتعكس بدقة التركيز على كل كتلة.

الآن قم بتعيين الحصول على الصورة في الوضع الخطي والحصول على الصور. بعد سلسلة التصوير الأولى ، أعد مصفوفات الآبار النانوية إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ست ساعات. يمكن أن يؤدي الاهتمام بالتحريض إلى إزاحة الخلايا.

ثم كرر الحصول على الصور في النقطة الزمنية الثانية. يقيس هذا الاختبار المحلل الخلوي عالي الإنتاجية تواتر التحلل الخاص بالمستضد المسمى CD 19 تم احتضان الخلايا التائية الإيجابية CAR الخاصة ب CD 19 مع أربع خلايا مستهدفة للفأر المسمى في الآبار الفردية لمصفوفة نانو L. تمثل مخططات الرسم البياني للخلية المستهدفة آبارا تحتوي على خلية مستجيب واحدة وخلية مستهدفة واحدة.

بعد ست ساعات من الحضانة المشتركة ، تم استخدام الرسوم البيانية المتطابقة للخلايا المستهدفة بدون مؤثرات كعناصر تحكم سلبية للإبلاغ عن تكرار موت خلايا الخلفية. من المستحسن تحقيق ترددات منخفضة من التحلل غير المحدد في حدود اثنين إلى 4٪ يمكن تكييف مصفوفة بئر النانو للتصوير بفاصل زمني للسماح بمراقبة المستجيب والاقتران المستهدف وموت الخلايا اللاحق. هنا تم احتضان الخلايا التائية الإيجابية للسيارة غير المسمى مع NA LM ست خلايا مستهدفة GFP في NOL وإخضاعها للمراقبة الديناميكية.

عندما تمت إضافة Xin five إلى وسائط الثقافة ، يتم تسمية الخلايا المبرمجة باللون الأحمر بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية بشكل صحيح في غضون 10 إلى 12 ساعة بعد هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل الاستيلاء الدقيق لتحديد ملف إفراز السيتوكين للخلايا.