تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

الهدف من هذا الإجراء هو تصور الحمض النووي الريبي المرسال المرتبط بالشبكة الإندوبلازمية أو er. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء خلايا زراعة أنسجة الثدييات أولا على زلات الغطاء. الخطوة الثانية من الإجراء هي معالجة الخلايا بمخزن مؤقت للاستخراج لإزالة mRNA السيتوبلازمي غير المرتبط ب er.

تتمثل الخطوات التالية في إصلاح الخلايا بسرعة وتلطيخ الرنا المرسال عن طريق التهجين الفلوري في الموقع. تتمثل الخطوات النهائية في تصوير ثم تحديد كمية التألق المرتبطة ب er. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج كيف ترتبط mRNAs بسطح هذه العضية في ظل ظروف مختلفة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة البيولوجية الرئيسية للخلية مثل ما إذا كان يمكن الحفاظ على mRNAs التي تشفر البروتينات الإفرازية على سطح er ، بغض النظر عن الريبوسومات أو تخليق البروتين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه يتضمن بعض خطوات التلاعب الخلوي الصعبة. بذر خلايا زراعة الأنسجة على زلات الغطاء المعالجة بالحمض لمدة يوم واحد على الأقل قبل التجربة تكلف سبعة ، ونظرا لأن خلايا OS هي خيارات مناسبة لأنها تحتوي على إنتاج بروتين عالي الإفراز وأجهزة ER محددة جيدا.

إذا تم التحقيق في مستر NA الخارجي ، فقم بنقل الخلايا بعد يوم واحد من البذر ثم احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة إضافية للسماح بالرنين المغناطيسي. تعبير NA. في يوم التجربة. لتحقيق كفاءة استخراج عالية ، يجب ألا تتجاوز الخلايا 80٪ من الطلاقة المشتركة على زلة الغطاء لاكتشاف ما إذا كانت mRNAs تتفاعل مع ER بشكل مستقل عن خلايا الترجمة يمكن معالجتها بعوامل تعطل التفاعل بين الريبوسومات و mRNA في هذه العوامل أو وسائط التحكم في الخلايا قبل 30 دقيقة من الاستخراج.

في هذه الحالة ، يتم استخدام مثبطات الترجمة ، Mycin النقي و Homo Harrington في أو HHT. ابدأ بتسخين محلول الاستخراج المحضر حديثا الذي يحتوي على تونين الحفر ومخزن مؤقت يعمل من XCHO واحد إلى 37 درجة مئوية. اضبط كتلة التسخين على 40 درجة مئوية وأدخل كتلة معدنية مقلوبة لتشكيل سطح عمل مستو.

بلل الكتلة المعدنية بالماء ، ثم قم بتغطيتها بقطعة جديدة من الطفيلي وقم بتنعيم أي فقاعات باستخدام قفازات خالية من الحمض النووي الريبي ومناديل خالية من النسالة. بعد ذلك ، لكل زوج من زلات الغطاء ، قم بإعداد صفيحة من ستة آبار لغسل الخلايا وتثبيتها في أربعة آبار. أضف ملليلترين من المخزن المؤقت CHO الدافئ إلى آخر بئرين.

أضف ملليلترين من محلول التثبيت. ثم قم بتخزين الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لحين الحاجة. على كتلة التسخين ، ضع قطرة 100 ميكرولتر من محلول الاستخراج لكل زلة غطاء من الخلايا المراد معالجتها.

الآن باستخدام ملقط صائغ ، التقط زلة غطاء مغلفة بالخلية واغمسها في الآبار الأولى والثانية التي تحتوي على مخزن CHO. هذا يغسل وسط النمو. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد بسرعة من الجانب الخلفي من زلة الغطاء.

ووضع جانب خلية انزلاق الغطاء لفترة وجيزة لأسفل على محلول الاستخراج. بعد 10 ثوان، انقل جانب خلية انزلاق الغطاء لأعلى إلى مخزن التثبيت المؤقت حيث يجب أن يبقى لمدة 15 دقيقة على الأقل. تعد خطوة استخراج الخلية ضرورية لإزالة كل الرنا المرسال البلاستيكي غير المرتبط ب ER.

بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد زلة غطاء التحكم حيث يتم تثبيت الخلايا بدون الاستخراج. خطوة بعد التثبيت. اغسل خلايا التحكم المستخرجة غير النشطة مرتين باستخدام PBS ثم نفاذية في PBS و TRITTON X 100.

على الرغم من أنه ليس مطلوبا ، إلا أنه يجب أيضا غسل الحفر في الخلايا المستخرجة بنفس محلول PBS و Triton لتقليل مضان الخلفية بعد تغلغل الخلايا. اغسل الشرائح مرتين باستخدام PBS لإزالة المثبت والمنظف. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام 60٪ fide في محلول سترات الصوديوم لمرة واحدة أو SSC.

ومع ذلك ، إذا تم استخدام مسبار الأسماك oligo DT لتلطيخ جميع الخلايا ، فإن poly mRNA يقلل من مستوى fide إلى 25٪ بعد ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتهجين باستخدام مسبار الأسماك. قم بتخفيف مسبار أسماك المخزون إلى 0.2 ميكرومولار بنفس تركيز fide في مخزن التهجين. الآن إعداد غرفة تلطيخ.

املأ قاع طبق بتري مقاس 150 ملم بالماء. ثم تطفو قطعة من الطفيلي على الماء واقلب الطبق رأسا على عقب. سوف يلتصق فيلم الفقرة بقاع الطبق أثناء هروب الماء.

إذا كان هناك أي فقاعات هواء ، فقم بإزالتها بالقفازات والمناديل الخالية من الوبر لكل ماصة زلة غطاء 100 ميكرولتر من محلول التهجين الذي يحتوي على مسبار الأسماك على الفيلم الصغير. الآن ضع جانب خلية انزلاق الغطاء لأسفل على المحلول. أخيرا ، احتضان الغرفة لمدة خمس إلى 24 ساعة في غرفة دافئة ومرطبة.

قبل انتهاء وقت تلطيخ الأسماك ، قم بإعداد منطقة غسيل خالية من الحمض النووي الريبي ، وسطح مستو أكثر رطوبة بالماء وقم بتغطيتها بشرائط من البارام. قم بإزالة أي فقاعات هواء بالقفازات والمناديل الخالية من الكتان. عند انتهاء التلوين ، انقل الغرفة إلى منطقة العمل لكل ماصة زلة غطاء مضع ملليلتر واحد من عازلة الغسيل على منطقة الغسيل.

فيلم Para لنقل زلات الغطاء الماصة الأولى نصف مليلتر من مخزن غسيل الأسماك بالقرب من حافة كل زلة غطاء. سيتم سحب السائل تحت زلة الغطاء عن طريق العمل الشعري. بعد ذلك ، باستخدام ملقط ، قم بإزالة زلات الغطاء من الغرفة وضعها على قطرات الغسيل العازلة.

وانتظر خمس دقائق. كرر تقنية الغسيل هذه ثلاث مرات أخرى. باستخدام قطرات مليلتر جديدة من محلول الغسيل في منطقة الغسيل.

وفي الوقت نفسه ، نظف الشرائح الزجاجية بنسبة 70٪ من الإيثانول وجففها بمناديل خالية من النسالة. ثم لكل زلة غطاء ، ضع 25 ميكرولترا من محلول تركيب DPI على شريحة باستخدام ملقط ، التقط زلة غطاء وجفف مؤخرتها بمنديل خال من النسالة لإزالة محلول الغسيل الزائد. ثم انقل جانب خلية انزلاق الغطاء متجها لأسفل على قطرة محلول التركيب.

يمكن تخزين الشرائح المكتملة عند أربع درجات مئوية حتى يتم تصويرها من التكلفة. تم استخراج سبع خلايا تم نقلها باستخدام البلازميدات التي تحتوي على الفوسفاتيز القلوي المشيمي أو السيتوكروم P 4 58 B واحدة باستخدام التونين ثم تم تثبيتها أو تثبيتها مباشرة لتحديد النسبة المئوية لهذه الرنا المرسال المرتبطة ب ER. تم قياس التألق غير النووي في كلتا العينتين وتم حساب جزء mRNA المرتبط ب ER لكل من mRNAs.

ارتبط حوالي 60٪ من الجزء السيتوبلازمي بغرفة الطوارئ لمراقبة ارتباط ER لهذه النصوص. بعد تكاليف تفكك الريبوسوم ، تمت معالجة سبع خلايا بوسائط التحكم ، أو MYCIN أو HHT ، ثم استخلاص التونين والحمض النووي الريبي المرسال الثابت. كشف التلوين أن A LPP ، ولكن ليس CYP ثمانية P واحد mRNA ظلت مرتبطة ب ER بعد اضطراب الريبوسوم.

دعم القياس الكمي للرنا المرسال هذه الملاحظة وأظهر بشكل مهم أن مستوى الرنا المرسال النووي كان ثابتا في جميع العينات. تكشف هذه البيانات أن مجموعة فرعية من mRNAs المستهدفة ER ، مثل نسخة A LPP ، يتم الاحتفاظ بها على سطح ER بعد تفكيك الريبوسوم. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا البدء في التحقيق في كيفية توطين الرنا المرسال المختلفة في مقصورات فرعية مميزة مثل الشبكة الإندوبلازمية عند دمجها مع المقايسات الأخرى المستخدمة لتحليل الصادرات النووية mRNA.

يمكن استخدام هذا الإجراء لدراسة الاستهداف الأولي ل mRNAs المركبة حديثا على سطح er.