Name: في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: اكتشف تقنية التصوير المباشر للخلايا لدراسة ديناميكيات البروتين أثناء تنشيط الخلايا التائية. تُقدم هذه الطريقة رؤى كمية حول تكوين المجمعات الإشارية في الوقت الفعلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

المؤلفان بالشكر صوفيا فرايد للحصول على المساعدة الفنية. MBS يشكر الجهات التالية للحصول على دعم أبحاثهم: مؤسسة العلوم الإسرائيلية للحصول على منح no.1659/08، 971/08، 1503-1508 و 491/10، وزارتي الصحة والعلوم للحصول على منح لا. 3-4114 3-6540 و، وجمعية السرطان اسرائيل من خلال تركة الراحل الكسندر Smidoda، ومؤسسة أسرة Taubenblatt للحصول على منحة التميز الادوية الحيوية.

<ol><li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+and+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li>
<li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+antimicrobial+peptides%3A+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li>
<li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li>
<li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+tumour+antigens%3A+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li>
<li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+colocalization+by+correlation%3A+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander%27s+overlap+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li>
<li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li>
<li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosines+113%2C+128%2C+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li>
<li>Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li>
<li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li>
<li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3(2012).</li>
</ol>

ليس لدينا أي تضارب في المصالح في الكشف عنها.

تنظيم وظيفة من العمليات الخلوية متعددة تعتمد على تشكيل وإنهاء البروتين البروتين التفاعلات. التصوير المجهري يسمح تتبع في الوقت الحقيقي من البروتينات الموسومة fluorescently في الخلايا الحية. Colocalization من البروتينات الموسومة يمكن أن تشير إلى التفاعل المباشر أو غير المباشر بين البروتينات، ويمكن استخدامها لتعزيز النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق أساليب الكيمياء الحيوية، مثل مناعي. خلافا لأساليب الكيمياء الحيوية، والتصوير الخلية الحية يسمح لهذه التفاعلات بين البروتينات التي يتعي...

<table><tbody><tr><td colspan = "4" ><قوي >كاشف / مادة < / قوي ></td></tr> <tr><td>Amaxa مجموعة نواة الخلايا التائية البشرية</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (استنساخ UCHT1) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>نظام الغطاء الألماني 4 شرائح غرفة </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td> <td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين ستربتومايسين </td><td>سيجما</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>بولي إل ليسين 0.1٪ (وزن / حجم) في H2O</td><td>سيجما</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>سيجما</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr> < td colspan = "4" ><قوي> المعدات < / قوي> </td></tr><tr><td>Accublock الحمام الجاف الرقمي</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي</td><td>Eppendorf</td> جهاز <td>طرد مركزي 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>مجهر متحد البؤر</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>إطار تركيب قابل للتسخين - إدراج تسخين P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (مطلوب لإطار التثبيت القابل للتسخين)</td> <td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>جهاز التثقيب الكهربائي</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>فارز الخلايا المنشط الفلوري</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>برنامج تحليل الصور</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

وتتوسط حماية ضد الأمراض المعدية من قبل 1،2 الجهاز المناعي. الخلايا اللمفية تي هي المنسقين ماجستير في الجهاز المناعي، وتنظيم وتفعيل والاستجابات من الخلايا المناعية متعددة 3،4. تي خلية التنشيط يعتمد على الاعتراف مستضدات محددة المعروضة بواسطة خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة). مستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCR) الخاصة بكل استنساخ خلايا T ويحدد مستضد خصوصية 5. الربط من TCR للمستضد الحث على الفسفرة من مكونات مجمع TCR. من أجل تعزيز تي خلية التنشيط، يجب ترانسدوسيد هذه إشارة من الغشاء إلى السيتوبلازم والنواة، وبدء مختلف الاستجابات حاسمة مثل تجنيد يشير البروتينات إلى TCR؛ موقع APC (المشبك المناعي)، وتفعيل الجزيئية، إعادة ترتيب هيكل الخلية، ارتفاع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، والتغيرات في التعبير الجيني 6،7. الصحيح فيitiation وإنهاء الإشارات تفعيل أمر حاسم لتي خلية الاستجابات المناسبة. النشاط من البروتينات مما يشير يعتمد على تشكيل وإنهاء البروتين البروتين التفاعلات، إضافة التعديلات متعدية مثل الفسفرة البروتين، وتشكيل المجمعات البروتين، ubiquitylation البروتين وتجنيد البروتينات لمختلف المواقع الخلوية 8. فهم الأعمال الداخلية للعملية التنشيط تي خلية أمر بالغ الأهمية لكلا البحوث المناعية والتطبيقات السريرية. وقد وضعت فحوصات مختلفة من أجل تحقيق البروتين البروتين التفاعلات، ولكن فحوصات الكيمياء الحيوية، مثل المستخدمة على نطاق واسع طريقة التعاون للمناعي، لا تسمح الموقع البروتين يمكن أن يلاحظ، مما يحول دون مراقبة من معلومات قيمة حول ديناميات الخلوية الآليات. بالإضافة إلى ذلك، معظم هذه المقايسات عادة الجمع بين البروتينات من العديد من الخلايا المختلفة التي قد تكون في مراحل مختلفة من رانه عملية التحقيق الخلوية. هذا يمكن أن يكون لها تأثير ضار على القرار الزماني. استخدام التصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا الحية يسمح كل من تتبع المكانية للبروتينات والقدرة على التمييز بين الأحداث يشير زمنيا، وبالتالي تسليط الضوء على ديناميات العملية 9،10. فإننا نقدم وسيلة من التصوير في الوقت الحقيقي من تشكيل الإشارات المعقدة خلال تفعيل الخلايا التائية. و transfected الأولية خلايا T أو T-خطوط الخلية، مثل Jurkat، مع البلازميدات ترميز للبروتينات ذات الاهتمام تنصهر إلى البروتينات الفلورية أحادى، ومنع oligomerization غير الفسيولوجية 11. يتم إسقاط تعيش خلايا تي خلال ساترة قبل المغلفة مع الأجسام المضادة الخلايا T-تفعيل 8،9، الذي يربط المجمع CD3/TCR، الأمر الذي أدى تنشيط خلايا T في حين التغلب على ضرورة تفعيل مستضدات محددة. يتم تصوير الخلايا تفعيلها باستمرار مع استخدام الفحص المجهري متحد البؤر. ويتم تحليل البيانات التصوير أن تسفر النتائج الكمية، مثل عمودمعامل ocalization من البروتينات الإشارة.

نقدم مثالا لايف التصوير T-خلية والتحليل. قبل التجربة والتصوير، وقد تم تحليل SLP76 خلايا T ناقص (J14) مع استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحديد التعبير عن البروتينات الفلورية (الشكل 1). أودعت خلايا T transfected مع البروتينات إشارات الموسومة MCFP-NCK وSLP76-mYFP أكثر الشرائح تفعيل وتصويرها خلال T-خلية من الانتشار (الشكل 2). الصور التي تم جمعها تظهر ديناميات توطين البروتين في جميع أنحاء تفعيل ونشر (الشكل 3). معالجة الصور بالحاس...

نحن تصف طريقة التصوير الخلية الحية التي توفر نظرة ثاقبة ديناميات البروتين أثناء عملية التنشيط تي خلية. ونحن لشرح الاستخدام المشترك لتي خلية نشر الفحص، الفحص المجهري متحد البؤر وتحليل التصوير أن تسفر النتائج الكمية لمتابعة إشارات تشكيل المعقدة في جميع أنحاء تي خلية التنشيط.

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

real-time-live-imaging-of-t-cell-signaling-complex-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

والتقسيم من البروتينات، سواء داخل غشاء البلازما أو في مواقع داخل الخلايا هي واحدة الآلية التنظيمية التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير نتائج إشارة، وبالتالي فهم إشارات من المهم دراسة السلوك المكاني والزماني للبروتينات المعنية. نحن هنا وصف نظام الفحص المجهري TIRF يستند إلى دراسة نقل الإشارات في الخلايا التائية، ولكن قابلة للتطبيق على نطاق واسع.

تقنية الفحص المجهري للTIRF التصوير، في الوقت الحقيقي في وقت واحد من TCR وما يرتبط بها من البروتينات اشارة

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لدراسة تكوين المشبك المناعي بين الخلايا التائية البشرية الأولية والطبقات الدهنية الثنائية المدعومة (SLB). تتفاعل بروتينات سطح الخلية التائية مع الروابط المعنية التي تم تجميدها على SLB لتشكيل مشبك مناعي ، تليها حركة الحبيبات اللايتية نحو المشبك ، والتي يتم تصورها باستخدام المجهر الفلوري.

تقنية في المختبر لدراسة تفاعل الخلايا التائية مع الطبقات الدهنية المستوية المدعومة

يوضح هذا الفيديو تصوير الخلايا الحية لطوبولوجيا المشبك المناعي ، والتحقيق في التفاعلات بين الخلايا الليمفاوية التائية والخلايا الظهارية التي تحمل مستضدات الفلورسنت. يكشف الفحص المجهري الفلوري عن إزاحة السيتوبلازم الأحمر وحلقات الغشاء الأصفر في الخلايا البطانية ، مما يشير إلى تكوين نقاط الاشتباك العصبي المناعية.

تقييم طوبولوجيا المشبك المناعي من خلال تصوير الخلايا الحية

يتم التحكم في المناعة التكيفية من خلال "المشابك المناعية" الديناميكية المتكونة بين الخلايا التائية والخلايا العارضة للمستضد. يصف هذا البروتوكول طرق التحقيق في الخلايا البطانية على أنها APCs فسيولوجية غير مدروسة وكنوع جديد من "نموذج APC الخلوي المستوي".

نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية

الآليات التي تحكم الحركة من خلالي CD4 المستجيب خلايا تي في مواقع الالتهاب غير معروفة نسبيا. نقدم نهجا غير الغازية لتصور والتلاعب في المختبر -primed خلايا CD4 T في الأدمة الأذن الملتهبة، والسماح لدراسة السلوك الديناميكي لهذه الخلايا في الموقع.

التصوير CD4 T خلية الخلالية الهجرة في الأدمة الملتهبة

للتحقيق في سرعات التدفق واتجاهية الأكتين الخيطي في المشبك المناعي للخلية التائية ، يتم دمج التصوير فائق الدقة للخلايا الحية مع تألق الانعكاس الداخلي الكلي وقياسه كميا باستخدام التحليل الطيفي لارتباط الصورة المكانية والزمانية.

القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات

ويصف هذا البروتوكول أسلوب المستندة إلى تصوير لتنشيط الخلايا اللمفية تي MHC الببتيد فوتواكتيفاتابل، مما يتيح مراقبة دقيقة الزمانية المكانية لتنشيط الخلية T باستخدام.

السيطرة المكانية والزمانية لتنشيط الخلية تي استخدام مؤثر فوتواكتيفاتابل

ويصف البروتوكول تقنية لدراسة قدرة خلايا تي البشرية [بولكلونل] أولية على شكل متشابك واجهات استخدام بليرس الدهن مستو. نحن نستخدم هذه التقنية لإظهار القدرة على تشكيل المشبك التفاضلية للبشرية من خلايا تي الأولية المستمدة من العقد الليمفاوية والدم المحيطي.

تقييم الواجهة متشابك لخلايا تي البشرية الأولية من الدم والأنسجة اللمفاوية

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية استخدام المجهر ورقة الضوء شعرية لأربعة الأبعاد تصور ديناميات مستقبلات السطح في الخلايا الحية. هنا يتم عرض مستقبلات الخلايا التائية على CD4+ الخلايا التائية الأولية.

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

صور هذا البروتوكول كلا من تشكيل المشبك المناعي وحركه المرور المستقطبة اللاحقة نحو المشبك المناعي. وشكلت الاقترانات الخلوية بين خليه راجي الفائقة النبض (التي تعمل كخليه لتقديم مستضد) واستنساخ Jurkat (بوصفها المساعد المستجيب T اللمفاوية).

تصوير المشبك المناعي البشري

هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لحل إشارات Ca2+ المحلية الأولية ، والمعروفة باسم المجالات الدقيقة Ca2 + ، في الفئران الأولية والخلايا التائية البشرية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. يعمل هذا البروتوكول كمورد قيم للباحثين الذين يفحصون مسارات إشارات Ca2 + داخل الخلايا المناعية والكشف عن وظيفتها.

تصوير المجالات الدقيقة الأولية Ca2+ في الخلايا التائية الأولية

اكتشف تقنية التصوير المباشر للخلايا لدراسة ديناميكيات البروتين أثناء تنشيط الخلايا التائية. تُقدم هذه الطريقة رؤى كمية حول تكوين المجمعات الإشارية في الوقت الفعلي.

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

استكشف المزيد من الفيديوهات