العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على مزارع الخلايا النجمية النقية عن طريق عزل وزراعة الخلايا القشرية المختلطة من P واحد إلى P أربعة صغار فأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد قشرة الدماغ أولا لصغار الفئران وإزالة السحايا. الخطوة الثانية هي تقطيع القشرة إلى قطع صغيرة ، وفصل قطع القشرة عن طريق التربسين والتيشن للحصول على خلايا مفردة ووضع الخلايا المفردة على قوارير ثقافة الأنسجة المطلية ببولي دي ليسين.

بعد ذلك ، بعد سبعة إلى ثمانية أيام ، ستشكل الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية قليلة التغصن طبقات مختلفة ويتم فصل الخلايا النجمية عن الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية قليلة التغصن عن طريق هز قارورة زراعة الأنسجة على شاكر مداري. الخطوة الأخيرة هي تأين وحصاد الخلايا النجمية المتبقية ، والتي يتم إعادة طلاؤها بعد ذلك في قارورة زراعة الأنسجة. في نهاية المطاف ، بعد 12 إلى 14 يوما من انقسام الخلية الأول ، يتم طلاء الخلايا النجمية بالتركيز المناسب للتجارب ويمكن فحص نقاء الخلية عن طريق كيمياء السيتو المناعية باستخدام علامات خاصة بالخلايا النجمية.

تعتمد الطريقة الموضحة هنا على تحضير مزرعة الخلايا النجمية من أدمغة القوارض حديثي الولادة التي وصفها مكارثي في الأصل وتطورت في عام 1980. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل الأسئلة المتعلقة بالتفاعل بين الخلايا العظمية والخلايا العصبية ، بالإضافة إلى دور الخلايا العظمية في بعض أمراض S ، حيث يتم تنشيط الخلايا العظمية وتساهم في تكوين ندبة مثبطة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا للعلماء الشباب للإشارة إلى الخطوات الحاسمة لطريقة العزل وتصور مورفولوجيا الخلايا النجمية أثناء الخطوات المختلفة لإجراء العزل لضمان ثقافات الخلايا النجمية النقية والصحية.

سيتم عرض هذا الإجراء من قبل اثنين من طلاب الدراسات العليا في مختبري ، سيباستيان هيلكر وكريستيان بورا قبل البدء في هذا الإجراء ، تأكد من تحضير جميع كواشف زراعة الأنسجة وكواشف ومواد التشريح مسبقا وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب. بعد التضحية بجرو فأر من P واحد إلى P أربعة فأر ، قم بإجراء شق خط الوسط من الخلف إلى الأمامي على طول فروة الرأس للكشف عن الجمجمة ، وقم بقطع الجمجمة بعناية من الرقبة إلى الأنف ، ثم قم بعمل قطع أمامي للبصلة الشمية وآخر أدنى من المخيخ. لفصل الجمجمة عن قاعدة الجمجمة ، استخدم ملقطا مسطحا لقلب اللوحات القحفية برفق إلى جانب واحد.

بعد ذلك ، قم بقطع البصيلات الشمية والمخيخ ، ثم ارفع الدماغ. ضع الدماغ في طبق من HBSS المبرد وضعه على الثلج. كرر الآن الإجراء لحصاد الأدمغة من ثلاثة إضافية.

ستوفر أربعة أدمغة ما يكفي من الخلايا النجمية لزرع قارورة ثقافة الأنسجة T 75 بالكثافة المناسبة. بمجرد حصاد جميع الأدمغة ، انقل الطبق الذي يحتوي على الأدمغة إلى مجهر استريو. بجانب عزل القشرة ، أمسك الطرف الخلفي لكل دماغ بالملقط الدقيق وقم بإجراء شق خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية.

ثم أدخل مجموعة ثانية من الملقط في الأخدود الذي تم إنشاؤه وقم بإزالة اللوحة مثل بنية القشرة من بقية الدماغ. بمجرد عزل جميع القشرة ، قم بتقشير السحايا بعناية بعيدا عن القشرة عن طريق السحب بالملقط الناعم. تتجنب هذه الخطوة تلوث ثقافة الخلايا النجمية النهائية بالخلايا السحائية والخلايا الليفية.

انقلي نصفي الكرة الأرضية المحضرين إلى طبق ثان مليء ب HBSS المبرد وضعيه على الثلج. استمر وفقا لذلك مع جميع القشرة الأربعة. أخيرا ، قم بتقطيع كل نصف كرة إلى أربع إلى ثماني قطع صغيرة باستخدام شفرات حادة في ظل ظروف معقمة.

انقل قطع القشرة إلى أنبوب صقر واحد سعة 50 مليلتر وأضف HBSS إلى الحجم النهائي البالغ 22.5 ملليلترا. ثم أضف 2.5 مل من 2.5٪ من الرحلات. استبدل مزيج الغطاء واحتضان الأنسجة في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

تخلط عن طريق رجها كل 10 دقائق. ثم بعد التمركز لمدة خمس دقائق عند 300 مرة G إلى الحبيبات. تصب قطع أنسجة القشرة بعناية المادة الطافية S.

أضف 10 ملليلتر من وسط طلاء الخلايا النجمية إلى الحبيبات ، واستخدم ماصة 10 ملليلتر لماصة الوسط الذي يحتوي على الأنسجة لأعلى ولأسفل بقوة 20 إلى 30 مرة حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة. بعد ذلك ، أضف وسيط طلاء الخلايا النجمية إلى الحجم النهائي البالغ 20 مل واحسب الخلايا باستخدام عداد خلية دموي أو آلي. وفقا للإجراءات القياسية ، يجب أن ينتج عن مستحضر واحد من أربعة قشريات جرو فأر 10 إلى 15 مرة 10 للخلايا المفردة الست المنفصلة.

أخيرا ، استنشق بولي دي ليسين من قارورة معدة مسبقا وانقل تعليق الخلية المنفصلة إلى القارورة. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة يومين ، ثم قم بتغيير الوسائط. يجب بعد ذلك تغيير وسائل الإعلام كل ثلاثة أيام.

بعد ذلك ، يجب أن تظهر الخلايا النجمية مكملة بطبقة علوية من الخلايا الدبقية الصغيرة بعد سبعة إلى ثمانية أيام في الثقافة. في هذه المرحلة ، اضبط قارورة T 75 على شاكر مداري مضبوطة على 180 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة ، أو التخلص من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة ، أو تدويرها لأسفل ولوحة للثقافة. ثم أضف 20 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية الطازجة ، واستمر في هز القارورة عند 240 دورة في الدقيقة لمدة ست ساعات لإزالة الخلايا السلائف قليلة التغصن.

نظرا لأن بعض OPCs لن تنفصل تماما عن طبقة الخلايا النجمية ، استمر في الاهتزاز بقوة باليد لمدة دقيقة واحدة. من أجل منع تلوث OPC ، مرة أخرى ، تخلص من supinate أو قم بتدويره على اللوحة لزراعة OPCs الخاصة بك. اشطف طبقة الخلايا النجمية المتبقية مرتين باستخدام PBS ، واستنشق PBS وأضف خمسة ملليلتر من الرحلات في EDTA في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية.

تحقق من انفصال الخلايا النجمية كل خمس دقائق وفرض انفصال الخلايا النجمية عن طريق ضرب القارورة على راحة يدك مرتين إلى ثلاث مرات. بمجرد انفصال الخلايا النجمية عن القارورة ، أضف خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا النجمية. قم بتدوير الخلايا عند 180 مرة جم لمدة خمس دقائق ، واستنشق السبينات وأضف 40 مل من طلاء الخلايا النجمية الطازجة. متوسط.

يجب أن تنتج قارورة T 75 من الخلايا القشرية المختلطة حوالي سنت واحد من الخلايا الست المخصبة للخلايا النجمية بعد لوحة المرور الأولى للخلايا الموجودة في قارورتين مزرعتين T 75 وتحتضن 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. قم بتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام ، بعد 12 إلى 14 يوما من لوحة التدليك الأولى ، والخلايا النجمية بتركيز الخلية المناسب قبل 24 إلى 48 ساعة من إجراء التجربة. يجب أن تنتج قارورة زراعة الأنسجة T 75 حوالي 1.5 إلى مرتين في 10 للخلايا الست بعد الانقسام الثاني.

تظهر هذه الصورة الخلايا القشرية المختلطة بعد يوم واحد من الطلاء. تشير الأسهم السوداء إلى الخلايا النجمية المتصلة بأسفل القارورة. يمكن رؤية الخلايا العصبية المحتضرة تطفو في الاستلقاء بعد ثلاثة أيام من طلاء الخلايا القشرية المختلطة.

تتشكل طبقة الخلايا النجمية كما هو موضح في الأسهم السوداء والخلايا العصبية تكاد تكون غائبة. تظهر نفس الثقافة القشرية المختلطة هنا بعد خمسة أيام من الطلاء. تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة الأولى و OPCs الموجودة أعلى طبقة الخلايا النجمية كما هو موضح في الأسهم السوداء كما هو موضح هنا.

تلتقي طبقة الخلايا النجمية تماما بعد سبعة أيام من طلاء الخلايا القشرية المختلطة. تظهر هذه الصورة ثقافة الخلايا النجمية المخصبة. بعد يومين من الانقسام.

تظهر الخلايا المرفقة مورفولوجيا الخلايا النجمية بكثافة منخفضة. هنا تشير المناطق إلى خلايا مفردة. بعد أسبوعين ، وصلت طبقة الخلايا النجمية إلى كثافة عالية.

شريط المقياس 10 ميكرون. توضح هذه الصورة نقاء ثقافات الخلايا النجمية. تظهر كل لوحة الخلايا التي تم إدخالها على صبغة مناعية لعلامات الخلايا النجمية ، G-F-A-P-G-L-A-S-T-S 100 B Aquaporin four A LDH ، واحد L واحد ، و BLBP موضح باللون الأخضر.

يتم الكشف عن النوى بواسطة صبغة مضادة ل DAPI. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا النجمية القشرية واستزراعها. يوفر عزل واستزراع الخلايا النجمية القشرية الموصوفة في هذا البروتوكول أداة قوية للتحقيق في بيولوجيا الخلايا النجمية.

نظرا لأن قابليتها للإدارة في التطبيقات المتنوعة يمكن أن تكمل تحقيقها بشكل كبير في الجسم الحي.