الكشف عن سرطان الجلد باستخدام المعدلات اسماك الزرد الموديل ورم الأصليين

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص معدلات الورم الميلانيني باستخدام نموذج الورم الذاتي لسمك الزرد. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء معدلة وراثيا تعبر فيها الخلايا الصباغية عن جين مثير للاهتمام وتكون الأسماك معرضة للإصابة بالورم الميلانيني. بعد ذلك ، يتم تسجيل ظهور الورم الميلانيني لتقييم ما إذا كان الجين المعني يغير بدء الورم.

ثم يتم إجراء غزو الورم والمقايسات الخاصة بالخلية لتحديد أي تأثير إضافي للجين ذي الأهمية على الأورام الميلانينية والخلايا الصباغية قبل الخبيثة. أخيرا ، يتم زرع خلايا الورم الميلانيني لقياس كيفية تأثير الجين المعني على تواتر الخلايا التي تبدأ الورم الميلانيني في الأورام الراسخة. توضح النتائج كيف يؤثر الجين المرشح على الخصائص المختلفة للخلايا الصباغية والأورام الميلانينية ، بما في ذلك بداية الغزو والقدرة على الزرع.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التطور الجرثومي لمسح جينات السرطان المرشحة هي توفير الوقت والجهد والنفقات ، وزيادة الإنتاجية عن طريق الفحص. جوانب مختلفة من تكوين الورم في المعدلة وراثيا الرنين وتوضيح هذا الإجراء سيكون شيرانيا أجار, طالب دراسات عليا في مختبري لتوليد تركيبات للحقن. ابدأ بإنشاء استنساخ إدخال منتصف البوابة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتضخيم إطار القراءة المفتوح الكامل للجينات ذات الأهمية وإعادة تجميعها في P don R 2 21.

ثم استخدم تقنية البوابة متعددة المواقع لإعادة تجميع جين محفز mifa الخاص بالخلايا الصباغية ذي الأهمية وإشارة polyadenylation في ناقل Cooper المصغر لوضع الجينات ذات الأهمية تحت سيطرة محفز mifa ، وحقن 25 بيكوغراما من كل استنساخ ، جنبا إلى جنب مع 25 بيكوغراما من TOL ينقل مرنا المرسال إلى خلية واحدة معدلة وراثيا ثلاثية متماثلة اللواقح أجنة الزرد. ميفا براف FP 53. الطافرة تعاني من نقص الخلايا الصباغية وعرضة للتحول وتكوين الورم الميلانيني.

جنبا إلى جنب مع الجين محل الاهتمام. يحتوي ناقل كوبر الصغير على جين صغير MVA ينقذ. لذلك ستقوم المحقونة بنجاح بتطوير الخلايا الصباغية التي تم إنقاذها ، والتي تعبر عن الجين محل الاهتمام.

احتضان الأجنة المحقونة عند 28.5 درجة مئوية بعد 24 ساعة من الإخصاب أو HPF. قم بإزالة أي أجنة ميتة بعد 72 ساعة من الإخصاب باستخدام مجهر تشريح تحت ضوء ساقط على خلفية بيضاء. اختر المعدلة وراثيا مع الخلايا الصباغية التي تم إنقاذها.

عندما تصل إلى أربعة أيام بعد الإخصاب ، انقلها إلى خزانات سعة ثلاثة لترات في مشتل منشأة أسماك الزرد. في عمر شهرين ، حدد التي تحتوي على مساحة واحدة على الأقل من إنقاذ الخلايا الصباغية أكبر من أربعة ملليمترات مربعة. فحص المختارة أسبوعيا بحثا عن وجود أورام.

عزل الحاملة للورم للدراسة. ارسم منحنيات البقاء على قيد الحياة خالية من سرطان الجلد مع تقدم العمر في الأسابيع على أبسا ونسبة البقاء على قيد الحياة خالية من سرطان الجلد على الإحداثيات. قارن بين ذات الخلايا الصباغية التي تعبر عن جين ذي أهمية للتحكم في التي تعبر عن EGFP والخلايا الصباغية.

استخدم اختبار ترتيب السجل لتحديد ما إذا كان المنحنيان مختلفين إحصائيا أم لا. لإجراء فحص غزو الورم. ابدأ باختيار أسماك الحمار الوحشي المعزولة التي تطور أورام ظهريا في منطقة بين الحدود الخلفية للدماغ الخلفي والحدود الأمامية للزعنفة الظهرية.

بعد أسبوعين من ظهور الورم الميلانيني ، استخدم التريكا للقتل الرحيم للأسماك بعد تثبيت الأسماك ودمجها في البارافين. اصنع خمسة مقاطع عرضية ميكرومتر من خلال الآفات. واحد. كل 50 ميكرومتر يقطع الآفة بأكملها بحيث يمكن تحديد نقطة الغزو الأعمق.

استخدم الهيماتين والإيوين لتلطيخ الأقسام. قم بتقييم غزو الورم عن طريق قياس ما إذا كانت الخلايا السرطانية لا تزال خارج الطبقة الكولاجينية أو المركبة أو تغزو العضلات الظهرية أو تغزو أكثر في العمود الفقري. تحديد الفرق الإحصائي بين مجموعتي العينات لإجراء تلطيخ مناعي.

قم بتخدير الأسماك في 0.17 ملليغرام لكل ملليلتر من التريكا بضوء ساقط تحت مجهر تشريح. استخدم ملقطا حادا رفيعا لنتف المقاييس الظهرية. الحرص على عدم إتلاف الخلايا الصباغية التي تحتوي على نصف المقياس

ضع المقاييس مباشرة من الملقط في ملليلتر واحد من المثبت واحتضانها في درجة حرارة الغرفة مع التقليب لمدة تزيد عن أو تساوي ساعتين. انقل الأسماك إلى مياه السمك وراقب الأسماك للتأكد من التعافي الناجح لتبييض الخلايا الصباغية المصطبغة. اغسل المقاييس الثابتة أولا في PBST مرتين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من محلول التبييض الطازج وقم بتغطيته بأقفال عطر أو غطاء لمنع الغاز من فتح الأنابيب. استمر في التبييض حتى تختفي الصبغة. ثم يغسل في PBST أربع مرات كل خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

احتضن لمدة 30 دقيقة على الأقل في محلول كتلة ، ثم احتضن بحوالي 400 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية ومحلول الكتلة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في اليوم التالي ، اغسل المقاييس ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في PBS في درجة حرارة الغرفة ، واحتضن بجسم مضاد ثانوي لمدة ساعتين إلى ليلة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الوقوف مع نقطة في البوصة ، ضع قطرة من الدرع المتجه على شريحة زجاجية وقم بتركيب المقاييس بحيث يكون الجانب المقعر من المقاييس متجها لأسفل ضد الشريحة. ضع غطاء زجاجي فوق العينات.

استخدمي طلاء أظافر شفاف لإغلاق الحواف ومراقبة الشرائح تحت المجهر الفلوري. بعد متلقي مشع ، سمكة كاسبر البالغة من العمر شهرين إلى ثلاثة أشهر مع 25 رمادية من تشعيع جاما قبل يوم واحد من الزرع. اسمح للأسماك بالتعافي في ماء السمك.

استخدم trica للقتل الرحيم لسمكة تحمل الورم ، وقطع الورم ووضعه في طبق بتري مع ما يقرب من خمسة ملليلتر من المرشح المعقم 0.9 XPBS مع 5٪ FBS مع الحلاقة ، قم بتقطيع الورم أثناء العمل في المحلول في درجة حرارة الغرفة ومع تكرار ماصة P 1000 لإنتاج خلايا مفردة. ارفع الحجم إلى 25 ملليلترا. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح شبكي 40 ميكرومتر وقم بالدوران في جهاز طرد مركزي منضدي عند 453 RCF لمدة 10 دقائق.

أعد تعليق الحبيبات في 0.9٪ PBS 5٪ FBS إلى التركيز المطلوب. باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، احسب العدد الدقيق للخلية وقم بتخفيف تعليق الخلية بحيث يكون حجم الحقن النهائي حوالي خمسة ميكرولتر. على سبيل المثال ، إذا كان سيتم حقن 50،000 خلية ، فيجب تخفيف تعليق الخلية إلى تركيز نهائي يبلغ 10،000 خلية لكل ميكرولتر.

بنقر الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية كل بضع دقائق لمنع تكتل الخلايا بنسبة 100٪ من الإيثانول و 0.9 XPBS. اغسل طرف شطبة بقياس 26 ثانية 7 0 و 1 و 10 ميكرولتر من حقنة هاميلتون مرتين إلى ثلاث مرات قبل تحميل المحقنة بخمسة ميكرولترات من تعليق الخلية. بعد تخدير السمكة المتلقية المشععة في trica ، ضعها على جانبها على منديل كيم رطب.

قم بتثبيت السمكة بيد واحدة وأدخل الإبرة بحيث يكون الشطبة متجها لأعلى بزاوية 45 درجة في جناح السمكة فوق التجويف البريتوني. حوالي منتصف الطريق بين الحدود الخلفية للدماغ الخلفي والحدود الأمامية للزعنفة الظهرية. اضغط برفق على المكبس.

اسمح للأسماك بالتعافي في مياه السمك العذبة وراقب الأسماك يوميا بحثا عن نقش الورم. إذا حدث النقش ، يمكن أيضا ملاحظة استمرار النمو وتطور المرض. تم حقن أجنة أسماك الزرد BRAF FP 53 MIFA ذات الخلية الواحدة بناقل Cooper المصغر الذي يحتوي على مجموعة الجينات المسرطنة للورم الميلانيني DB واحد أو EGFP كل منها تحت سيطرة محفز MFA كما هو موضح هنا.

كشفت منحنيات حدوث الورم للبالغين أن SET DB واحد أدى إلى تسريع ظهور الورم الميلانيني بشكل كبير مقارنة بالتحكم في EGFP كما هو موضح هنا ، يظهر تلطيخ الهيماتين و EOSIN أن الأورام الميلانينية التي تعبر عن SET DB one كانت أكثر توغلا محليا من الأورام الميلانينية للتحكم في EGFP. يوضح هذا الشكل قشور ظهرية لسمك الزرد المبيض أو غير المبيض الملطخة بجسم مضاد يتعرف على عامل نسخ mifa الموضعي النووي لتقييم قدرة الورم على الزرع. تم عزل خلايا الورم الميلانيني من سمكة BRAF FP 53 mifa التي تم حقنها بكوب صغير R-E-G-F-P تم حقن 50 ، 000 خلية تحت الجلد في متلقي كاسبر متحولة تم تعريضها للإشعاع في اليوم السابق مع 25 رمادية كما يتضح هنا من عمر أسبوعين.

تم التعرف بسهولة على الخلايا المشتقة من المتبرع المصطبغ. لذلك بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السرطان لدراسة العواقب الوظيفية للتغيرات الجينية المرتبطة بالورم الميلانيني باستخدام سمك الزرد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص معدلات الورم الميلانيني عن طريق الفحص ، والاختلافات في غزو ظهور الورم ، والتعبير الجيني والقدرة على الزرع باستخدام نموذج الورم التلقائي لسمك الزرد.