الطرق التجريبية لاختبار آثار الببتيد عصبية، ADNF-9، ضد موت الخلايا المبرمج الناجم عن الكحول أثناء فترة الحمل في C57BL / 6 الفئران

الهدف من هذا الإجراء هو تقييم التأثيرات الوقائية العصبية للببتيدات الغذائية في نموذج التعرض للكحول للجنين. يتم تحقيق ذلك عن طريق تزاوج التجارب أولا ثم علاج الإناث الحوامل بالببتيدات الغذائية كخطوة ثانية ، يتم تشريح الأجنة لعزل أدمغة الجنين للاستخدامات التجريبية. بعد ذلك ، يتم تضمين أدمغة الجنين في الجيلاتين للتقسيم ، متبوعا بتلوين النفق لتحديد نتائج موت الخلايا.

يظهر أن التعرض للكحول قبل الولادة يزيد من عدد الخلايا الإيجابية للنفق في بروز العقدة. بالمقارنة مع إعطاء المجموعة الضابطة للببتيد الغذائي ، قلل A D و F تسعة بشكل كبير من الزيادة الناجمة عن الكحول في الخلايا الإيجابية للنفق مقارنة بالحيوانات المعالجة بالكحول الضابط. لذا فإن العرض المرئي لهذا المعدن أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم تشريح دماغ الجنين والخطوات المضمنة لأن أدمغة الجنين صغيرة جدا لتشريحها ومعالجتها لتقسيم السلالة الأولى C 57 ستة فئران سوداء عن طريق وضع إناث الفئران البالغة من العمر ستة أسابيع والتي يبلغ وزنها حوالي 20 جراما في أقفاص منزلية للذكور لمدة ساعتين مباشرة بعد الإزالة.

افحص كل أنثى بحثا عن وجود سدادة منوية للتأكد من حدوث التزاوج. إذا كانت سدادة المنوية موجودة ، فقم بتعيين هذا اليوم الجنيني صفر على E سبعة وزن يتطابق مع الإناث الحوامل في أربع مجموعات. تم توفير مجموعة واحدة من النظام الغذائي السائل الكحولي كوصول مجاني كمصدر وحيد للعناصر الغذائية.

اثنان من مجموعة التحكم Perfed ثلاثة مجموعة معالجة الببتيد ، والتي يجب أن تتلقى حقنة داخل الصفاق من DNF تسعة ببتيد جنبا إلى جنب مع التعرض للكحول. النظام الغذائي السائل. سجل حجم النظام الغذائي السائل الذي تستهلكه في 24 ساعة من أنابيب الغطاء اللولبي المتدرجة سعة 30 مليلتر لتحديد الكمية اليومية من الكحول أو النظام الغذائي السائل أو النظام الغذائي السائل المزدوج الذي يمكن توفيره عبر فائض مجاني كمصدر وحيد للعناصر الغذائية.

تأكد من توفير نظام غذائي سائل طازج يوميا من E 7 إلى E 13 بعد التضحية بالحامل Myer E 13 عن طريق القتل الرحيم بثاني أكسيد الكربون ، يليه خلع عنق الرحم. ضع الذبيحة على لوح التشريح في وضع ضعيف ونظف البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم مقصا وملقطا معقما لعمل شق في البطن.

بمجرد فتح البطن ، أمسك الرحم بالملقط واستخدم ملقطا ثانيا لتمزيق بطانة الرحم ببطء ورفق بعيدا عن الرحم دون ثقب الأجنة. قم بإزالة الأجنة بعناية من الرحم ونقلها إلى محلول فرز التوازن من هانك في طبق ثقافة خلية 60 ملم × 15 مليلتر على ثلج مبلل ، ضع الطبق ووعاء الثلج على مسرح مجهر استريو باستخدام ملقط فائق الدقة للتشريح المجهري. اسحب جلد الأجنة في الجزء العلوي من الرأس لكشف الجمجمة.

بمجرد أن تتعرض الجمجمة وتصورها بوضوح تحت المجهر الاستريو ، أمسك قاعدة الجمجمة على مستوى الحبل الشوكي وجذع الدماغ بالملقط وابدأ في تقشير الجمجمة. استمر في تقشير الجمجمة قطعة قطعة من الأجزاء الخلفية إلى الأمامية من الرأس. بمجرد أن يتعرض الدماغ بالكامل ، استخدم الملقط لاستخراجه.

ثم قم بتشريح دماغ الجنين من قاعدة البصلة البدائية أو المصنعية إلى قاعدة Met Postfix ، وجميع أدمغة الجنين التي تم تشريحها في 4٪ بارالديهايد لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. يمكن أيضا تجميد أدمغة الجنين إذا تم اختبارها بحثا عن اللطخة الغربية أو المقايسات الأنزيمية. بعد تحضير محلول 10٪ من الجيلاتين من الدرجة الأولى المحضر في الماء المقطر ، املأ قالب التضمين في منتصف الطريق وانتظر حتى يتجمد الجيلاتين.

ضع أدمغة الجنين المهدبة والمعالجة قبل الولادة جنبا إلى جنب فوق الجيلاتين المتصلب. هذا للحفاظ على ظروف متسقة بين كل من المجموعة الضابطة والتجريبية. تأكد من أن الجيلاتين ليس ساخنا جدا وأضف الجيلاتين السائل فوق أدمغة الجنين لعمل قالب كامل.

يجب أن يشبه القالب النهائي هذه الصورة ، قم بتبريد قالب الجيلاتين المحضر الذي يحمل أدمغة الجنين لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، انزع قالب التضمين البلاستيكي. يجب أن يبدو القالب النهائي هكذا ثم ينقل الجيلاتين المحتوي على أدمغة الجنين إلى 4٪ بارالديهايد لمدة يومين.

في اليوم الثالث ، قم بإرفاق كتلة الجيلاتين التي تحتوي على أدمغة جنينية ثابتة بمرحلة الفيوم. ثم قم بتقسيم الأدمغة باستخدام مجموعة فيوم بسمك 25 إلى 50 ميكرون للتقسيم الإكليلي. اجمع أقسام دماغ الجنين في PBS ، ثم قم بتركيب أقسام دماغ الجنين على الصقيع الفائق بالإضافة إلى الشرائح في الماء واتركها تجف لمدة 15 دقيقة.

بعد انقضاء 15 دقيقة. ضع الشرائح في PBS لاختبار تفاعل النفق في اليوم التالي. أولا ، اغمر الشرائح في محلول 20 ميكروغراما لكل مليلتر من بروتيناز K و PBS لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

ثم اشطفها ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر مداري. احتضان الأقسام بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون اهتزاز. ثم اغسل الشرائح كما كان من قبل.

بعد ذلك ، احتضان الأقسام في محلول منفذ لمدة دقيقتين على الجليد. بعد الحضانة تغسل مرتين في PBS. كما كان من قبل ، استخدم أنسجة المختبر لتجفيف منطقة الشريحة حول الأقسام.

ثم استخدم قلم التربيت للرسم حول الأقسام الموجودة على الشريحة. هذا يمنع تسرب محلول التلوين ، مما يسمح باستخدام حجم صغير. احتضان قسما واحدا في كل زوج بخليط تفاعل النفق المحضر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

أضف حل ناقل بدون كاشف نفق إلى قسم التحكم السلبي. ثم احتضان الشرائح لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS على شاكر مداري كما كان من قبل.

ثم جفف المنطقة المحيطة بالأنسجة بمنديل مختبري. بعد ذلك ، احتضان الأقسام بمحلول POD المحول لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز. ثم اشطف الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل منها باستخدام tris HCL.

انقل الشرائح إلى حامل وضعها في وعاء كوبلن يحتوي على 0.05٪ DAB و 0.003٪ بيروكسيد الهيدروجين. غطي البرطمان بورق الألمنيوم وضعيه على شاكر مداري على الثلج لمدة سبع دقائق بعد الحضانة وغسل PBS كما كان من قبل إذا رغبت في ذلك. يمكن تخزين الشرائح في PBS قبل الشروع في تلطيخ الصواريخ كما هو مفصل في الجزء النصي من البروتوكول.

تظهر الصور التالية تأثيرات الببتيد العصبي ، A DNF تسعة ضد موت الخلايا المبرمج الناجم عن الكحول باستخدام مقايسة النفق في البروز العقدي حيث أدى التعرض للكحول قبل الولادة في مرحلة E 13 إلى زيادات في موت الخلايا كما هو موضح في رؤوس الأسهم في مجموعة A LC مقارنة بمجموعة PF. أدت إدارة A D NF التسعة إلى جانب التعرض للكحول قبل الولادة إلى انخفاض في الخلايا الإيجابية للنفق. أظهر التحليل الإحصائي أن إدارة AD و F التسعة منعت الزيادات الناجمة عن الكحول في الخلايا الإيجابية للنفق.

تظهر القيم كوسائل زائد ناقص الخطأ المعياري للمتوسط. تشير علامة النجمة الواحدة إلى قيمة P أقل من 0.052. تشير علامة النجمة إلى قيمة P أقل من 0.01 بواسطة اختبار نيومان كولز اللاحق.

احتوت كل مجموعة على N من أربعة. لذلك بعد تطويرها ، هذه الطريقة التقنية للباحثين ومجال تنمية الدماغ لاستكشاف آثار الأدوية أو المركبات وتطور الدماغ في الفئران.