تقنيات بسيطة وفعالة لإعداد تعليق خلية الخصية

سيتم في هذا الفيديو عرض بروتوكول بسيط وفعال للغاية للحصول على معلق خلوي للمواد المختبرة من القوارض في غضون 15 دقيقة فقط. وقد طُبقت هذه الطريقة على عينات من الفئران والجرذان وخنازير غينيا، وتستخدم جهاز ميتاماشين (meta machine) لتفكيك الأنسجة المغلفة. وبعد عملية الترشيح والصبغ، يصبح المعلق الخلوي جاهزاً للتدفق الخلوي.

تحليل الخلايا أو فرزها؛ يعد تجانس المجموعات الخلوية شرطاً أساسياً لتحليل الأحداث البيوكيميائية والجزيئية أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الذكرية. لذا، يمثل التباين النسيجي للخصية، التي تضم أكثر من 30 نوعاً مختلفاً من الخلايا، إحدى المشكلات الرئيسية المتعلقة بدراسة الأساس الجزيئي لتكون الحيوانات المنوية في الثدييات. لهذا السبب، استُخدمت طرق متنوعة للحصول على مجموعات خلوية خصوية مثرية أو منقاة، بما في ذلك تدرج الكثافة وتجزئة الطرد المركزي.

تتمثل الخطوة الأولى في أي طريقة لفصل الخلايا في تحضير معلق خلوي. ومع ذلك، فإن البروتوكولات الحالية عادة ما تستغرق وقتاً طويلاً وقد تؤدي إلى فقدان الجزيئات قصيرة العمر مثل RNAs، وهو أمر غير مرغوب فيه لتحليلات التعبير الجيني اللاحقة. تكمن الميزة الرئيسية للبروتوكول المقدم هنا في أنه يلغي الخطوات الفاصلة بين التضحية بالحيوان والدراسات الجزيئية المحددة لمرحلة الحيوانات المنوية، ولكنه يضمن في الوقت ذاته جودة جيدة وتمثيلاً ممتازاً لأنواع الخلايا في المعلقات الخلوية.

ستقوم الدكتورة Ana Rodriguez، الباحثة في مختبر AL والتي طورت هذه الطريقة، بتقديم شرح للإجراء، وسينضم إليها Federico San Lopez المتخصص في قياس التدفق الخلوي والذي كان مسؤولاً عن التحليل السيتومتري. يتطلب هذا الإجراء جهازاً صغيراً، وهو نظام meach، مع ملحقات medicon وfcon الخاصة به. ومع ذلك، يمكن استبدال ملحقات fcon تماماً بأغشية نايلون ذات حجم مسام مماثل.

المواد والكواشف الإضافية المطلوبة فقط هي ناشر زجاجي، وطبقين، ومقص وملاقط، ومحقنة سعة 3 إلى 5 مل، وغرفة تحضين، ووسط استزراع DMEM مُدعم بـ 10% من مصل العجل الجنيني وNDA. إذا كانت هناك تطبيقات لاحقة تتضمن معالجات لـ RNA، فيجب التعامل مع جميع المواد والمحاليل وفقًا لذلك لتنفيذ البروتوكول. ضع الخصية التي تم تشريحها في طبق زجاجي قطر 96 ملم يحتوي على 10 مل من وسط DMEM المُدعم والمبرد.

قم بإزالة الـ TAL Virginia، وقطّع الخصية المقطوعة إلى قطع مربعة يتراوح طول ضلعها بين 2-3 mm. ضع أربع إلى خمس من هذه القطع في أنبوب medicon مخصص للاستخدام مرة واحدة ومفكك، مع إضافة 1 mL من الوسط المكمل بـ D، ثم عالجها في نظام meta machine لمدة 50 ثانية. تحتوي كل وحدة medicon على مصفاة ثابتة من الفولاذ المقاوم للصدأ بها حوالي مائة ثقب سداسي تحيط بها ست شفرات دقيقة.

يتم نقل النسيج إلى كل ثقب بواسطة دوار معدني داخل غرفة medicon، ثم يتم تفكيكه عبر المرور فوق الثقوب المسننة ومن خلال الغربال المعدني، بينما تقوم مضخة دقيقة أسفل الغربال بتزويد السائل وجرف القشور. استرجع النتيجة في صورة معلق خلوي من medicon باستخدام حقنة بحجم 3 إلى 5 مليمتر بدون إبرة. بعد ذلك، انقع أنبوب falcon بمسامية 50 ميكرومتر أو شبكة نايلون ذات حجم 4 ميكرومتر في نصف مليمتر من الوسط، ثم قم بترشيح المعلق من خلالها.

كرر الخطوة، ولكن باستخدام شبكة نايلون بقطر 25 micrometer أو وحدة falcon مكافئة وضعها على الثلج، ثم خذ عينة ALI من معلق الخلايا للعد في غرفة noyer واضبط التركيز الخلوي ليكون من 1 إلى 2 × 10⁷ خلية لكل milliliter في الوسط الزراعي. وأخيراً، أضف NDA بتركيز نهائي قدره 0.2% لتجنب تكتل الخلايا وأيضاً لتجنب انسداد الجهاز أثناء دراسات التدفق اللاحقة. إذا كان من المقرر تقييم حيوية الخلايا، فيمكن إجراء ذلك باستخدام طقم قياس حيوية الخلايا الحية والميتة للخلايا الحيوانية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، وقبل تحليل قياس التدفق الخلوي، أضف صبغة فلورية.

سيعتمد اختيار الفلوروكروم على الليزرات المتاحة. في هذا العرض التوضيحي، سيتم عرض استخدام صبغات مختلفة ترتبط بـ DNA. وعلى الرغم من أن صبغة propidium iodide هي الصبغة المعتادة للخلايا المثبتة أو الميتة بتركيزات منخفضة، فقد وجدنا أنه عند استخدامها بتركيزات عالية، فإنها تدخل الخلايا الخصوية غير المثبتة في المعلقات التي تم تحضيرها بالطريقة المقدمة هنا.

يعود ذلك على الأرجح إلى الإجهاد الميكانيكي المترتب، والذي قد يؤدي، بالتزامن مع الطبيعة الحسية للظهارة شبه المنقية، إلى تكسر الجسور الرابطة بين الخلايا عند إجراء أدنى عمليات المناولة. ولصباغة يوديد البروبيديوم، يتم إضافة المحلول بتركيز نهائي قدره 50 µg/mL إلى معلق الخلايا قبل 10 دقائق من تحليل العينات، مع التحضين عند درجة حرارة 0 °C في الظلام لتحليل الخلايا المصبوغة بيوديد البروبيديوم. ولإجراء المزيد من الفرز، نستخدم جهاز قياس التدفق الخلوي FACS Vantage المجهز بليزر أيونات الكريبتون المتسق والمضبوط للانبعاث عند 488 nm. يتم ضبط قدرة الليزر على 100 mW، ويتم تجميع الفلورة المنبعثة من يوديد البروبيديوم بواسطة كاشف FL2 باستخدام مرشح تمرير نطاق 575/26.

استخدم فوهة بحجم 70 micrometer لقياسات قياس التدفق الخلوي وبرنامج squa لتحليل المعاملات التالية: التشتت الأمامي، والتشتت الجانبي، وإجمالي الفلورة المنبعثة أو مساحة النبضة، ومدة الانبعاثات الفلورية أو عرض النبضة. تُعرض النتائج في رسوم بيانية تمثل عدد الأحداث عند كل مستوى فلوري، وفي مخططات D التي تعرض التشتت الجانبي مقابل مساحة النبضة الفلورية، ومساحة النبضة الفلورية مقابل عرضها.

يتم استبعاد المزدوجات (Doublets) من التحليل باستخدام مخططات DO لمساحة النبضة الفلورية مقابل عرضها لفرز مجموعات الخلايا الوحيدة SM، مع ضبط وضع الفرز في جهاز fax vantage على الوضع normal R أو normal C، واستخدام ثلاث قطرات مفروزة كغلاف. اضبط تفاضل العينة لتحليل الخلايا بمعدل 500 إلى 1500 خلية في الثانية. حافظ على درجة حرارة أنابيب العينة والجمع بين 3 إلى 4 °C باستخدام وحدة تبريد.

وبدلاً من ذلك، يمكن صبغ الخلايا الموجودة في المعلق باستخدام فلوروكروما ت أخرى. على سبيل المثال، يمكن استخدام الصبغة الحيوية HER 3 3 3 4 2 بتركيز نهائي قدره 5 µg/mL، وتحضينها لمدة 10 دقائق على الأقل عند درجة حرارة 37 °C مع حمايتها من الضوء.

عينات مصبوغة بعدد 3، 3، 3، 4، 2. تم إجراء تحليل الخلايا بواسطة مقياس تدفق خلوي MO مجهز بليزر بطول موجي للإثارة فوق بنفسجية يعمل بقدرة 25 milliwatts وفوهة بحجم 70 micrometer. استخدم برنامج Summit 4.3 أو برنامجاً مماثلاً لتحليل المعلمات نفسها المشار إليها سابقاً عند تحليل معلقات الخلايا تحت بصريات تباين الوجه لمراقبة جودة المعلقات.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في المقام الأول في تحضير معلقات الخلايا الخصوية باستخدام الجهاز، والحصول عليها في غضون 15 دقيقة فقط بما في ذلك استئصال الخصية، وتقطيع الأنسجة، والمعالجة بالجهاز، والترشيح؛ حيث تعادل هذه الفترة الزمنية حوالي ثمن الوقت الذي تستغرقه البروتوكولات الأخرى عادةً. إن إيجاز هذا البروتوكول إلى جانب الحد الأدنى من المناولة يفسر الحفاظ الجيد على الجزيئات الكبيرة قصيرة العمر، وهو أمر بالغ الأهمية عندما تكون هناك حاجة إلى عينة ممثلة للمركبات الموجودة في التجمع الخلوي الأصلي. وبما أن الطريقة تتضمن حدًا أدنى من المناولة، فإنها سهلة التكرار في هذا الجدول.

تُعرض النسب المئوية النسبية لمجموعات الخلايا الخصوية المختلفة لسبع تجارب مستقلة أجريت على جرذان بالغة وحُللت بواسطة قياس التدفق الخلوي كمثال لإظهار مدى تكرارية هذه الطريقة. وبخلاف معظم الجسيمات المستخدمة حالياً لتحضير معلقات الخلايا الخصوية، فإن الطريقة المعروضة هنا لا تتضمن أي تفاعل إنزيمي. وعلى الرغم من أن تقطير الكولاجينيز في RNAs، وهي الإنزيمات المدرجة عموماً، يساهم في تفكيك الأنسجة بشكل غير كافٍ، إلا أنها قد تؤثر على الحفاظ على الجزيئات الكبيرة ذات الأهمية.

إن عدم استخدام المعالجات الإنزيمية لا يعزز الحفاظ على RNA والبروتينات فحسب، بل يجعل البروتوكول أقل تكلفة أيضاً. وعلى الرغم من التقارير السابقة التي أشارت إلى أن المعلقات الخلوية المحضرة ميكانيكياً تميل للتكتل بشكل أكبر مقارنة بتلك المعالجة بالتربسين، فقد وجدنا أن هذا البروتوكول يؤدي إلى الحصول على معلقات خلوية مفككة جيداً في غياب الإنزيمات. كما ثبت أن إضافة NDA مفيدة جداً في منع تكتل الخلايا.

تظهر الجودة العالية للمعلقات أيضاً عند إخضاع العينات للتحليل السيتومتري، وهو ما يتضح من خلال الحد الأدنى من الحطام الخلوي الملحوظ. ووفقاً للمعلومات المنشورة، فإن حوالي 13% من الحيوانات المنوية المستديرة توجد كنوى متعددة، سواء عند تحضير المعلقات الخلوية بطريقة ميكانيكية بحتة أو في وجود التريبسين. ومع ذلك، فإن العديد من المعلقات المحضرة آلياً تُظهر ندرة في النوى المتعددة، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تقليل التشابك، حيث ذُكر أن النوى المتعددة تنتج أساساً نتيجة لمعالجة الأنسجة.

يظهر في هذه الصورة مثال لمعلق خلوي من خصية جرذ تم تحضيره باستخدام جهاز Minced Tissue Homogenizer. وكما يتضح، فإن السيتوبلازم محفوظ بشكل جيد، كما أن النسب المئوية النسبية لمجموعات الخلايا 2C و 4C في المعلقات الخصوية المحضرة بهذا الجهاز لمختلف القوارض كانت مشابهة لتلك الموجودة في الأنابيب المنوية السليمة.

يدعم هذا الافتراض بأن الطريقة الموصوفة هنا لا تسبب ضرراً انتقائياً لأي نوع محدد من الخلايا. ومن المثير للدهشة أن تمثيل أنواع الخلايا في العديد من المعلقات التي يتم تحضيرها آلياً يتم الحفاظ عليه بشكل أفضل بكثير مما هو عليه في طرق تحضير التقطير التقليدية. وكما يتضح، فإن الرسوم البيانية الخلوية التي تم الحصول عليها لمعلقات الخلايا الخصوية المعالجة لا تختلف بشكل جوهري عن تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقاً.

في الواقع، تُظهر المدرجات التكرارية ومخططات النقاط التي تم الحصول عليها المجموعات الخلوية الخصوية الثلاث المميزة (4C إلى C و C) بناءً على محتوى DNA، بالإضافة إلى مجموعة subha الظاهرة، والتي تمثل الحيوانات المنوية أحادية الصيغة الصبغية شديدة التكاثف. وقد لوحظت هذه المخططات إما في معلقات مصبوغة بـ her sustained أو بـ propidium iodide على التوالي، وينطبق ذلك على العينات البالغة واليافعة أيضاً. وقد تم تحقيق فرز الخلايا المكونة للنطاف بنجاح بنقاء يتجاوز 98%، سواء للمجموعات الخصوية المختارة بناءً على محتوى DNA أو حتى للمجموعات الفرعية التي لها نفس محتوى DNA ولكن بمستويات تكاثف كروماتين مختلفة مثل sleep tine و tine myocytes.

كما لاحظنا في تعليق اختبارات خنزير غينيا، وبما أن البروتوكول لا يتضمن معالجة الـ RNA، فإن المجموعات السكانية المفروزة تظهر جودة جيدة للـ RNA وتسمح بدراسات التعبير الجيني التفاضلي حتى بالنسبة للمجموعات المصبوغة بـ propidium iodide. وفي هذا الصدد، يجدر التذكير بأنه على عكس الأصباغ الأخرى، فإن propidium iodide يصبغ الـ DNA وكذلك الـ RNA مزدوج السلسلة؛ ومع ذلك، في هذه الرسوم البيانية لتحليل تعليق خصية خنزير غينيا، فإن الملفات التعريفية المتشابهة التي تم الحصول عليها باستخدام propidium iodide بالتوازي مع vibrant ized cycle orange، وهو صبغ حيوي متخصص في الـ DNA، تُظهر أن صبغ الـ RNA لا يؤثر بشكل كبير على أنماط المدرج التكراري القياسي للتدفق الخلوي.

تلخص هذه القائمة المزايا الرئيسية للبروتوكول المذكور. تتيح الطريقة المحسنة الموصوفة هنا تسريع عملية تحضير معلقات الخلايا الخصوية المناسبة للتحليل السيتومتري لمراحل مختلفة من الحيوانات المنوية للقوارض في غضون 15 دقيقة فقط، بما في ذلك تشريح الخصية، وتقطيع الأنسجة، ومعالجتها عبر نظام جهاز ME. إن القصر في الوقت، والجودة العالية في إمكانية التكرار، ونسب أنواع الخلايا في معلقات الخلايا تجعل هذه الطريقة بديلاً جيداً لتقنيات التحضير الذاتي الأخرى الأكثر ترهلاً واستهلاكاً للوقت والمستخدمة حالياً.

علاوة على ذلك، وبما أن هذه الطريقة تتضمن تعاملاً محدوداً جداً وتتجنب استخدام الإنزيمات والمنظفات، فإنها تعد خياراً مثالياً للتطبيقات اللاحقة الدقيقة مثل دراسات التعبير الجيني.