تقنيات بسيطة وفعالة لإعداد تعليق خلية الخصية

في هذا الفيديو ، سيتم تقديم بروتوكول بسيط وفعال للغاية للحصول على تعليق خلوي لمواد الاختبار من القوارض في 15 دقيقة فقط. تم تطبيق الطريقة لاختبار الاختبار من الفئران وخنازير غينيا الفئران وتستخدم جهازا ميتا لتفكيك الأنسجة المغلفة. بعد الترشيح والتلوين ، تكون خلية الخلية جاهزة للتدفق.

تحليل أو فرز Cyto يعد تجانس مجموعات الخلايا شرطا أساسيا لتحليل الأحداث الكيميائية الحيوية والجزيئية أثناء تمايز GA للذكور. وبالتالي ، فإن عدم تجانس الخصية مع أكثر من 30 نوعا مختلفا من الخلايا يمثل أحد المشكلات الرئيسية المتعلقة بدراسة الأساس الجزيئي لتكوين المنوية للثدييات. لهذا السبب ، تم استخدام طرق مختلفة للحصول على إثراء مجموعات خلايا الخصية المنقاة ، بما في ذلك PU والتوضيح بالطرد المركزي.

الخطوة الأولى لأي طريقة لفصل الخلايا هي تحضير التعليق الخلوي. ومع ذلك ، عادة ما تستغرق البروتوكولات الحالية وقتا طويلا وقد تعني فقدان الجزيئات قصيرة العمر مثل الحمض النووي الريبي ، وهو أمر غير مرغوب فيه لتحليل التعبير الخفي. الميزة الرئيسية للبروتوكول المقدم هنا هي أنه يلغي الخطوات بين التضحية بالحيوانات والدراسات الجزيئية الخاصة بمرحلة المنوية ، ولكن في نفس الوقت يضمن جودة جيدة وتمثيلا ممتازا لنوع الخلية في المعلقات الخلوية.

ستظهر الدكتورة آنا رودريغيز ، الباحثة في مختبر AL التي طورت الطريقة وقياس التدفق الخلوي Federico San Lopez المسؤولة عن تحليل القياس الخلوي. يتطلب الإجراء قطعة صغيرة من المعدات ، نظام الخوخ ، مع ملحقاته الطبية وFCON. ومع ذلك ، يمكن استبدال ملحقات fcon تماما بأغشية نايلون من نفس حجم المسام.

المواد والكواشف الأخرى الوحيدة المطلوبة هي انتشار الزجاج ، وطبقين ، ومقص وملقط ، وغرفة أمعاء مزعجة من ثلاثة إلى خمسة ملليلتر ، ووسط ثقافة DMM مكمل بمصل سعال الجنين بنسبة 10٪ و NDA. إذا تم التخطيط لتطبيقات المصب التي تنطوي على معالجة الحمض النووي الريبي ، فيجب معالجة جميع المواد والحلول وفقا لذلك لتنفيذ البروتوكول. ضع الخصية المقطعة في كوب 96 ملم لكل بيانات تظهر الجليد الذي يحتوي على 10 ملليلتر من الثلج المكملة يسمى dm.

قم بإزالة TAL Virginia ، وقم بتقطيع خصية الرأس إلى قطع مربعة من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات على كل جانب. ضع أربع إلى خمس من هذه القطع في ميديكون غير منفصل يمكن التخلص منه جنبا إلى جنب مع مليلتر واحد من الكود المكمل D ومعالجته في نظام الجهاز الفوقي لمدة 50 ثانية. تحتوي كل وحدة طبية على شاشة ثابتة من الفولاذ المقاوم للصدأ بها حوالي مائة ثقب سداسي محاط بست شفرات صغيرة.

يتم إحضار الأنسجة إلى كل ثقب بواسطة دوار معدني داخل غرفة ميديكون ويتم إلغاء الفصل عنها عن طريق المرور فوق الثقوب الحادة وعبر الشاشة المعدنية بينما تزود المضخة الصغيرة الموجودة أسفل الشاشة السائل وتطرد الهياكل من الجسم. استرجع النتيجة في تعليق الخلية من medicon باستخدام حقنة من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات بدون إبرة. بعد ذلك ، انقع صقرا بحجم 50 ميكرومتر أو نفس شبكة النايلون ذات الأربعة أحجام مع نصف مليلتر متوسط وقم بتصفية التعليق من خلاله.

كرر الخطوة ، ولكن باستخدام شبكة نايلون 25 ميكرومتر أو وحدة صقر مكافئة وضعها على الجليد ، خذ اقتباسا من ALI لتعليق الخلية للعد في غرفة نوير واضبط التركيز الخلوي إلى واحد إلى اثنين في 10 الخلايا السبع لكل مليلتر في وسط الثقافة. أخيرا ، أضف NDA إلى التركيز النهائي البالغ 0.2٪ لتجنب ضخ الخلايا وأيضا لتجنب انسداد العضلات أثناء دراسات التدفق اللاحقة. إذا كان المقصود تقييم صلاحية الخلية ، فيمكن إجراء ذلك عن طريق مجموعة صلاحية الحياة الميتة الحية للخلايا الحيوانية باتباع تعليمات الشركة المصنعة قبل تحليل قياس التدفق الخلوي ، أضف صبغة فلورسنت.

يعتمد اختيار الفلوروكروم على الليزر المتاح. في هذا العرض التوضيحي ، سيتم عرض استخدام الأصباغ المختلفة التي تربط الوثيقة بالحمض النووي. على الرغم من أن حمية البروبيديوم هي الصبغة المعتادة للخلايا الثابتة أو الميتة بتركيزات منخفضة ، فقد وجدنا أنه عند استخدامها بتركيزات عالية ، يدخل ROM خلايا الخصية غير المثبتة في المعلقات المحضرة بالطريقة المعروضة هنا.

ربما يرجع ذلك إلى الإجهاد الميكانيكي الضمني ، والذي يمكن أن يؤدي إلى اقتران الطبيعة الحسية للظهارة الشماوية إلى كسر الجسور التي تربط الخلية بالخلية بأقل قدر من التلاعب لتلوين يوديد البروبيديوم قبل 10 دقائق من تحليل العينة في المحلول بتركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام لكل مليلتر إلى تعليق الخلية واحتضان صفر درجة مئوية في الظلام لتحليل خلايا بقعة البروبيديوم مو . لمزيد من الفرز ، نستخدم مقياس تدفق الأفضلية بالفاكس المزود بليزر أيون طرجون متماسك تم ضبطه للانبعاث عند 488 نانومتر. يتم ضبط طاقة الليزر على مائة مللي واط ويتم جمع مضان البروبيديوم الأول المنبعث من كاشف FL two باستخدام مرشح تمرير 5 7 5 مائل 26 نطاق.

استخدم فوهة 70 ميكرومتر لقياسات قياس التدفق الخلوي وبرنامج squa لتحليل المعلمات التالية. الانتثار الجانبي المبعثر الأمامي ، إجمالي التألق المنبعث أو مساحة النبضة ومدة الانبعاثات الفلورية أو عرض النبضة. يتم عرض النتائج بالجرام الذي يمثل عدد الأحداث في كل مستوى فلوري وفي المخططات D التي تعرض الانتثار الجانبي مقابل منطقة النبضة الفلورية ومنطقة النبضة الفلورية مقابل عرضها.

يتم استبعاد الزوجات من التحليل باستخدام مخططات DO لمنطقة نبضة الفلورسنت مقابل عرضها لفرز مجموعات الخلايا الوحيدة SM مع وضع فرز مجموعة مراقبة الفاكس في R العادي أو C العادي واستخدام ثلاث قطرات مصنفة كمغلف. اضبط تفاضل العينة لتحليل الخلايا بمعدل 500 إلى 1500 في الثانية. احتفظ بأنابيب العينة والجمع من ثلاث إلى أربع درجات مئوية باستخدام وحدة التبريد.

بدلا من ذلك ، يمكن تلطيخ الخلايا الموجودة في المعلق بالفلوروكرومات الأخرى. على سبيل المثال ، الصبغة الحيوية. يمكن استخدام HER 3 3 3 4 2 بتركيز نهائي يبلغ خمسة ميكروغرام لكل مليلتر وتحضنه لمدة 10 دقائق على الأقل عند 37 درجة محمية من الضوء لهيرش.

3 ، 3 ، 3 ، 4 ، 2 عينات وصمة عار. تم إجراء تحليل الخلية عن طريق مقياس التدفق الخلوي MO المجهز بليزر الطول الموجي للإثارة فوق البنفسجية يعمل عند 25 مللي واط وفوهة 70 ميكرومتر. استخدم برنامج Summit 4.3 أو ما شابه ذلك لتحليل نفس المعلمات المشار إليها من قبل عندما يتم تحليل تعليق الخلية تحت بصريات تباين الوجه ، يتم ملاحظة جودة تعليق القطع.

المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي في المقام الأول تعليق خلايا الخصية المعدة باستخدام العديد من الآلات والحصول على 15 دقيقة فقط بما في ذلك اختبار القسم C ، وقطع الأنسجة ، والألم ، ومعالجة الماكينة والترشيح ، وهذه المرة تمتد حوالي ثمن الوقت الذي تستغرقه عادة البروتوكولات الأخرى. إن إيجاز هذا البروتوكول جنبا إلى جنب مع الحد الأدنى من التسليم المعني من شأنه أن يفسر الحفاظ الجيد على الجزيئات الكبيرة قصيرة العمر ، وهو أمر بالغ الأهمية عندما تكون هناك حاجة إلى عينة تمثيلية من المركبات الموجودة في مجموعة الخلايا الأصلية. نظرا لأن الميثان ينطوي على الحد الأدنى من المناولة ، فمن السهل تكراره في هذا الجدول.

يتم تقديم النسب النسبية لمجموعات خلايا الخصية المختلفة لسبع تجارب مستقلة أجريت على الفئران البالغة وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي كمثال لإظهار قابلية استنساخ الطريقة. على عكس معظم الجسيمات المستخدمة حاليا لتحضير معلقات خلايا الخصية ، فإن الطريقة المعروضة هنا لا تنطوي على عمل إنزيمي. على الرغم من أن قطرة الكولاجيناز في الحمض النووي الريبي ، وهي الإنزيمات المدرجة بشكل عام ، تساهم في عدم كفاية فصل الأنسجة ، إلا أنها يمكن أن تؤثر على الحفاظ على الجزيئات الكبيرة ذات الأهمية.

يؤدي الافتقار إلى العلاجات الأنزيمية إلى الحفاظ على الحمض النووي الريبي والبروتين فحسب ، بل يجعل البروتوكول أرخص أيضا. على الرغم من أنه تم الإبلاغ سابقا عن أن معلقات الخلايا المعدة ميكانيكيا تتجمع بسهولة أكبر من تلك المعلقة المعدة ، فقد وجدنا أن هذا البروتوكول يؤدي إلى معلقات خلوية غير منفصلة جيدا في غياب الفعل الأنزيمي. أثبت إدراج اتفاقية عدم الإفشاء أنه مفيد جدا في منع تكتل الخلايا.

تتجلى الجودة الجيدة للمعلقات أيضا عندما تخضع العينات لتحليل القياس الخلوي كما هو محدد من خلال الحد الأدنى من حطام الخلية الذي لوحظ. وفقا للمعلومات المنشورة ، تم العثور على حوالي 13٪ من المنوية المستديرة على أنها متعددة النوى إما عندما يتم تحضير معلقات الخلايا بطريقة ميكانيكية حصرية أو في وجود التربسين. ومع ذلك ، فإن العديد من المعلقات المعدة آليا تجعل النوى متعددة النوى نادرة جدا ، على الأرجح بسبب تقليل التشابك ، حيث ذكر أن النوى المتعددة يتم إنتاجها بشكل أساسي نتيجة للتلاعب بالأنسجة.

لوحظ في هذه الصورة مثال على العديد من تعليق الخلايا المحضر آليا من خصية الفئران. كما يتضح. يتم الحفاظ على السيتوبلازم بشكل جيد ، والنسب النسبية ل C ، واثنين من C ، وأربعة مجموعات من الخلايا C في العديد من معلقات الخصية المعدة آليا للقوارض المختلفة التي أعيد تجميع تلك الموجودة في PEs السليمة.

هذا يدعم الافتراض بأن الطريقة الموضحة هنا لا تلحق الضرر بشكل انتقائي بأي نوع خلية معين. من المثير للدهشة أن تمثيل نوع الخلية في العديد من المعلقات المعدة آليا يتم الحفاظ عليه بشكل أفضل بكثير من طرق تحضير التنقيط الكلاسيكية. كما يتضح ، فإن رسومات cyto التي تم الحصول عليها لمعلقات خلايا الخصية المعالجة بالمين لا تؤجل بشكل كبير عن تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا.

في الواقع ، تظهر الرسوم البيانية والمخططات النقطية التي تم الحصول عليها مجموعات خلايا الخصية الثلاثة المميزة من C إلى C و C بناء على محتوى الحمض النووي بالإضافة إلى مجموعة subha على ما يبدو ، والتي تمثل المنوية أحادية الصيغة الصبغية عالية التكثيف. لوحظت هذه الملامح إما لتعليق بقع يوديد البروبيديوم المستمر أو البروبيديوم على التوالي ، وهذا يرمز إلى عينات البالغين والأحداث أيضا. تم تحقيق فرز الخلايا الانقسامية بنجاح بأكثر من 98٪ نقاء ، إما لمجموعات الخصية المختارة بناء على محتوى الحمض النووي أو حتى للمجموعات السكانية الفرعية التي تحتوي على نفس محتوى الحمض النووي ، ولكن مستوى تكثيف الكروماتين المختلف مثل أسنان النوم والخلايا العضلية القصيرة.

كما يمكن أن نلاحظ في معلقات اختبار خنزير غينيا ، نظرا لأن البروتوكول لا يشمل علاج الحمض النووي الريبي ، فإن المجموعات المصنفة تقدم جودة جيدة للحمض النووي الريبي وتسمح بدراسات التعبير الجيني التفاضلي حتى بالنسبة للمجموعات الملطخة بيوديد البروبيديوم. بهذا المعنى ، تجدر الإشارة إلى أنه على عكس الأصباغ الأخرى ، بقع يوديد البروبيديوم ، الحمض النووي وكذلك الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، ومع ذلك ، في هذه الرسومات لتحليل تعليق خصية خنزير غينيا ، تم الحصول على الملامح المماثلة باستخدام يوديد البروبيديوم بالتوازي مع دورة برتقالية نابضة بالحياة. هذه صبغة حيوية خاصة بالحمض النووي تظهر أن تلطيخ الحمض النووي الريبي لا يؤثر بشكل كبير على أنماط الرسم البياني الخلوي.

تلخص هذه القائمة المزايا الرئيسية لبروتوكول النسبة المئوية. تسمح الطريقة المحسنة الموضحة هنا بتسريع إعداد معلقات خلايا الخصية المناسبة للتحليل الخلوي لمراحل المنوية المختلفة من القوارض في 15 دقيقة فقط ، بما في ذلك تشريح الخصية وقطع الأنسجة ومعالجتها من خلال نظام آلة ME. إن الإيجاز وجودة التكاثر العالية ونسب نوع الخلية في معلقات الخلية تجعلها بديلا جيدا لتقنيات الإعداد الذاتي الأخرى الأكثر مملة واستهلاكا للوقت المستخدمة حاليا.

علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذه الطريقة تنطوي على القليل جدا من التلاعب وتتجنب الإنزيمات والمنظفات ، فهي خيار مثالي للتطبيق الدقيق في اتجاه مجرى النهر مثل دراسات التعبير الجيني.